基于Fe_3O_4@SiO_2/Ni-NTA磁性微球的His-tag融合蛋白纯化体系的建立

合成了表面共价结合Ni-氨基三乙酸(Ni-NTA)基团的Fe3O4@SiO2微球,这种磁性微球可用于分离含有His-tag标签的融合蛋白.微球中心由尺寸约402 nm的Fe3O4微粒组成,赋予了微球极好的磁性分离和离心分离的特性.应用Fe3O4@SiO2/Ni-NTA磁性微球对含有6×His-tag(6聚组氨酸)标签的蛋白进行了分离纯化,结果表明,10 mg Fe3O4@SiO2/Ni-NTA微球能够从10 mL重组蛋白裂解液中纯化出约1 mg带有6×His-tag标签的融合蛋白.微球的高效分离效果使其能够用于含量较低的带有6×His-tag标签蛋白的分离纯化.

脂肪来源基质细胞的扩增及多分化潜能研究

目的建立人脂肪来源的基质细胞（ADSCs）的分离和扩增方法,探讨ADSCs的多向分化潜能。方法采用胶原酶消化法分离扩增人ADSCs,测定其生长的经时变化、累积生长倍数等;应用不同因子诱导ADSCs向脂肪细胞及神经元样细胞分化并进行鉴定。结果每100ml脂肪抽吸物中可分离得到2×10^7-4×10^7个有核细胞,60d内扩增至P8;油红O染色、免疫细胞化学染色及RT-PCR证实ADSCs经诱导可分化为脂肪细胞及神经元样细胞。结论建立了ADSCs的扩增培养方法,扩增培养的ADSCs具有旺盛的增殖能力,并且具有向脂肪细胞及神经元样细胞分化的潜能。有望作为一种成体多能干细胞应用于组织工程及细胞治疗。

人抗狂犬病毒抗体在毕赤酵母中的分泌表达

目的经分步整合法在巴氏毕赤酵母中表达人抗狂犬病毒全分子抗体。方法分别构建人重链和轻链抗体表达质粒,以分步整合法电转化X33酵母菌,甲醇诱导表达后进行ELISA筛选及Western blot分析。结果SDS-PAGE、Western blot检测均在分子量约55kD及25kD处出现特异性条带,ELISA检测显示所获全分子抗体具有良好的狂犬病毒抗原结合活性,表达量约8～10mg/L。结论在毕赤酵母菌中可经甲醇诱导产生具狂犬病毒抗原结合活性的分泌型人全分子抗体。

^(131)I标记抗c-erbB-2单克隆抗体对卵巢癌动物模型的生长抑制作用

目的:用131I标记抗c-erbB-2单克隆抗体,探讨其对荷人卵巢癌裸鼠的生长抑制作用。方法:将抗c-erbB-2单克隆抗体与131I偶联,制成免疫靶向药物,将已接种卵巢癌SKOV3细胞且肿瘤直径已达1.0cm的裸鼠分为131I标记抗c-erbB-2单克隆抗体3.7MBq低剂量组和11.1MBq高剂量组,以131I标记的mIgG(非治疗性抗体)为对照组,对三组荷人卵巢癌裸鼠模型分别进行肿瘤局部注射,于用药当日后6周内每周测量肿瘤体积、质量,计算抑瘤率,并与对照组进行比较。结果:131I标记抗c-erbB-2单克隆抗体3.7MBq低剂量组和11.1MBq高剂量组与对照组比较肿瘤体积减小(P<0.05)、肿瘤质量减轻(P<0.05)、抑瘤率增高(P<0.05),同时131I标记抗c-erbB-2单克隆抗体11.1MBq高剂量组肿瘤体积和肿瘤质量低于3.7MBq低剂量组(P<0.05)、抑瘤率高于3.7MBq低剂量组(P<0.05)。结论:131I标记抗c-erbB-2单克隆抗体对荷人卵巢癌裸鼠肿瘤的生长有明显的抑制作用,且以131I标记抗c-erbB-2单克隆抗体11.1MBq剂量作用强于3.7MBq剂量。

人脐带间充质干细胞的分离培养及成脂成骨分化

目的建立小胎龄人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离和培养方法,探讨hUCMSCs的成脂、成骨分化潜能。方法采用Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶消化法从胎龄12～18w的流产胎儿脐带中分离hUCMSCs;流式细胞仪检测其免疫表型;应用不同因子诱导hUCMSCs向脂肪细胞及成骨细胞分化并进行鉴定。结果体外培养的hUCMSCs呈长梭形,细胞形态均一;表达CD29、CD44、CD73、CD105、CD166;不表达CD34、CD45、CD40、CD40L、CD80、CD86、HLA-DR;油红O、茜素红染色及RT-PCR证实hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论建立了小胎龄hUCMSCs分离培养方法,证实其具有成脂、成骨分化潜能,有望成为细胞治疗及组织工程更为理想的种子细胞。

人脂肪来源间充质干细胞成骨及成软骨的潜能

背景：人脂肪来源间充质干细胞是种具有较强的体外增殖和多系分化能力的成体干细胞,可以从美容吸脂手术中获得,取材方便,原料来源丰富,在生物治疗应用方面蕴藏着巨大的价值。目的：体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,探讨其基本生物学特性及成骨成软骨的潜能。方法：取美容吸脂获得的脂肪组织,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养;观察细胞形态、测定细胞周期、流式细胞仪鉴定细胞表面标志;取第3代细胞,分别加入成骨诱导培养基及成软骨诱导培养基行体外成骨及成软骨诱导。结果与结论：体外培养人脂肪来源间充质干细胞呈纤维样形态,原代细胞24h内贴壁,培养5-7d后开始形成细胞集落;经细胞周期检测显示G0/G1,S和G2/M所占比例分别为（88±2）%,（12±2）%和0.03%。经流式细胞仪检测CD29和CD105呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达。RT-PCR检测显示,人脂肪间充质干细胞经成骨诱导分化后细胞中骨桥蛋白mRNA呈阳性表达,经软骨诱导分化后细胞中Ⅱ型胶原mRNA呈阳性表达。结果证实,实验成功体外分离、培养人脂肪来源间充质干细胞,其具有向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能。

蜂毒肽对卵巢癌生长抑制作用的实验研究

目的研究蜂毒肽对卵巢癌细胞株及卵巢癌皮下移植瘤动物模型的生长抑制作用。方法选取卵巢癌细胞株SKOV3,以四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法观察蜂毒肽对SKOV3的生长抑制作用。通过建立卵巢癌皮下移植瘤动物模型来观察蜂毒肽对移植瘤的生长抑制作用。结果体外实验观察到蜂毒肽对卵巢癌细胞株生长有抑制作用,并且随着其浓度的增加抑制作用增强。在卵巢癌皮下移植瘤动物模型中,注射蜂毒肽各组瘤重明显低于对照组(P<0.05)。结论蜂毒肽可明显抑制卵巢癌细胞株及卵巢癌皮下移植瘤的生长并且随着蜂毒肽的浓度增加抑制作用增强。

抗C-erbB-2单克隆抗体在荷人乳腺癌裸鼠体内的预定位显像

目的以153Sm标记的抗C-erbB-2单克隆抗体对荷人乳腺癌移植瘤裸鼠进行肿瘤预定位显像的研究。为乳腺癌早期诊断提供一种新方法,并为其临床应用提供实验依据。方法实验I组每只裸鼠采用三步预定位法从尾静脉注射7.4 MBq/0.1 ml的153Sm-DTPA-C-erbB-2 McAb实验II组与II组分别直接从尾静脉注射7.4 MBq/0.1 ml的135 Sm-C-erbB-2及135Sm-IgG并于于注射后2、4、8、24h行全身SPECT显像。于4、82、4 h分批处死裸鼠并测定分别在肿瘤、血液、心脏、肺等重要脏器单位重量的放射性比值(%ID/g)。结果在运用预定位技术加药的实验I组在给药后2小时开始有抗体在肿瘤组织浓聚,在8小时时达到最高,与实验II组直接给予抗体比较,血液本底低,两组比较差异有显著性(P<0.05)。结论应用预定位技术的实验组,瘤/血液比值高,血液本底低,周围正常组织吸收剂量低,显像效果好。

抗CD_3单克隆抗体激活杀伤细胞高效扩增培养体系的建立及细胞毒活性检测

目的：建立从20mL外周血中高效扩增抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞（CD3AK）的培养体系,并进行体外细胞毒活性检测。方法：采用抗CD3单克隆抗体（Anti-CD3mAb）激活人外周血单个核细胞（PBMC）,在人重组白细胞介素2（rIL-2）的协同活化下,获得CD3AK。对CD3AK进行长期体外培养,进行增殖动力学、免疫表型和体外抗肿瘤活性的分析。结果：在培养第7-22天,CD3AK增殖倍数明显提高,最高可达317倍;免疫表型分析显示,CD3^＋细胞从活化前的51.9%增加至94.6%,CD4^＋细胞从19.5%增加至51.1%,CD8^＋细胞从22.1%增加至52.1%;效靶比20∶1组和40∶1组的杀伤肿瘤细胞活性明显高于10∶1组（P〈0.05和P〈0.01）;在7-19 d的培养天数之内,杀伤肿瘤细胞活性最强。结论：从外周血中高效扩增的CD3AK是以CD3^＋、CD4^＋和CD8^＋细胞为主的异质性细胞群,在体外有明显的杀伤肿瘤细胞活性。

兔脂肪间充质干细胞胰岛素分泌功能的体外诱导

目的研究兔脂肪间充质干细胞体外诱导分化为具有胰岛素分泌功能的细胞的可能性。方法采用贴壁法分离兔脂肪间充质干细胞,培养、传代后,以胰高糖素样多肽(GLP-1)和尼克酰胺作为诱导剂进行诱导分化。对诱导后的细胞进行双硫腙染色及葡萄糖刺激胰岛素分泌试验,ELISA法检测胰岛素含量。结果细胞诱导后逐渐聚集成细胞团,双硫腙染色呈砖红色,诱导后第14天培养液中可检测到胰岛素,第21天浓度较14d增高,高糖组[(21.5±1.6)μIU/ml]比低糖组[(18.1±2.5)μIU/ml]略高,且差异有显著意义。结论兔脂肪间充质干细胞在体外一定诱导条件下,具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能。

人源化卵巢癌单链抗体基因的构建与表达

目的:通过基因工程技术获得完全人源化的卵巢癌患者自身的单链抗体并在毕氏酵母中获得表达,为人源化单链抗体(ScFv)在卵巢癌的诊断与治疗的应用提供实验基础。方法:用TRIZOL法自卵巢癌患者的淋巴细胞中提取RNA,利用SOEingPCR方法分别获得VH、VL基因,构建真核表达载体pPICZα/ScFv。电转化毕赤酵母菌株X-33。用PCR法筛选转染阳性克隆,SDS-PAGE法鉴定甲醇诱导的培养上清液中的ScFv的表达,筛选高表达工程菌。结果:构建ScFv基因,VH与VL连接后得到700bp左右的条带,ScFv基因在毕赤酵母中获得表达,在26000处出现目的条带。结论:获得ScFv基因及其真核表达载体以及高效表达ScFv的毕赤酵母工程菌。

人分泌型Klotho蛋白在CHO细胞中的稳定表达

目的在CHO细胞中稳定表达人分泌型Klotho(hsKL)蛋白,制备具有天然结构的重组hsKL(rhsKL)蛋白。方法用PCR法自克隆载体pBS-hskl中克隆hsKLDNA,构建真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)-hskl。经核酸测序确证后,阳离子聚合物转染CHO细胞。用PCR法筛选具有Zeocin抗性的阳性细胞克隆,SDS-PAGE(银染色)法确定CHO细胞分泌蛋白的分子量,Western印记法鉴定CHO细胞的培养上清液中的rhsKL蛋白,确定稳定转染细胞株CHO-hsKL。结果经PCR法克隆的序列与GeneBank登录的hsklmRNA序列一致。将hsKLDNA定向插入pcDNA3.1/Zeo(+),构建pcDNA3.1/Zeo(+)-hskl真核表达载体并通过阳离子聚合物转染CHO细胞获得Zeocin抗性的转染阳性克隆。SDS-PAGE和Westernblot分析显示,转染的CHO培养上清中含有分子量约为66kDa的rhsKL蛋白。结论首次实现天然结构的hsKL蛋白的重组表达——获得稳定表达细胞株CHO-hsKL。

抗C-erbB-2单克隆抗体在荷人胃癌裸鼠体内的预定位显像

目的以153Sm标记的抗C-erbB-2单克隆抗体对荷人胃癌移植瘤裸鼠进行肿瘤预定位显像的研究。为胃癌早期诊断提供一种新方法,并为其临床应用提供实验依据。方法实验Ⅰ组每只裸鼠预定位法从尾静脉注射7.4MBq/0.1ml实验Ⅱ组与Ⅲ组分别直接从尾静脉注射7.4MBq/0.1ml的135Sm-C-erbB-2及135Sm-IgG并于于注射后2、4、8、24h行全身SPECT显像。于4、8、24h分批处死裸鼠并测定分别在肿瘤、血液、心脏、肺等重要脏器单位重量的放射性比值(%ID/g)。结果在运用预定位技术加药的实验I组在给药后2h开始有抗体在肿瘤组织浓聚,在8h时达到最高,与实验Ⅱ组直接给予抗体比较,血液本底低,两组比较差异有显著性。(P<0.05)。结论应用预定位技术的实验组,瘤/血液比值高,血液本底低,周围正常组织吸收剂量低,显像效果好。

人脂肪基质细胞向胰岛素分泌细胞的分化诱导

目的:体外分离培养人脂肪来源基质细胞(hADSCs),并定向诱导hADSCs向胰岛样细胞分化,探讨hADSCs分化为胰岛素分泌细胞的潜能。方法:从脂肪抽吸物中分离hADSCs,利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、上皮细胞生长因子(EGF)、尼克酰胺和exendin-4等因子诱导hADSCs向胰岛样细胞分化。采用RT-PCR检测诱导前后胰岛素、胰十二指肠同源性盒因子(Pdx-1)、葡萄糖转运因子2(Glu-t 2)和胰高血糖素(glucagon)基因的表达;双硫腙染色鉴定胰岛样细胞团;免疫荧光染色检测诱导后细胞胰岛素和Pdx-1的表达;ELISA检测诱导后细胞在低糖和高糖环境中胰岛素的分泌量。结果:诱导7 d左右细胞由长梭形逐渐变成多边形,并且细胞开始呈岛状聚集,21 d左右形成胰岛样细胞团。双硫腙染色阳性;RT-PCR显示,诱导后细胞表达胰岛素、Pdx-1、Glu-t2和glucagon基因;免疫细胞化学显示,诱导后细胞表达胰岛素和Pdx-1;葡萄糖刺激实验显示胰岛素的释放,并且随着葡萄糖浓度增加胰岛素的释放量也增加。结论:体外hADSCs具有分化为胰岛素分泌细胞的潜能,为将来应用于临床移植治疗糖尿病奠定了基础。

兔脂肪源性间充质干细胞的扩增及其基本生物学特性

目的探讨兔脂肪间充质干细胞在体外的基本生物学特性。方法选取清洁级新西兰大白兔4只,采用Ⅱ型胶原酶消化兔腹股沟区皮下脂肪组织.贴壁法培养脂肪间充质干细胞。检测细胞生长动力学,测定生长因子EGF对细胞生长的影响,采用免疫细胞荧光法检测基质细胞表面抗原CD_(44)、CD_(45)。结果所培养细胞由P0传代至P8,每代倍增数目未发现有下降趋势;EGF具有显著的促进ADSCs增殖的作用,所培养细胞表达CD_(44)抗原,荧光显傲镜下呈红色荧光,CD_(45)近似于阴性表达。结论由兔脂肪组织分离扩增脂肪间充质干细胞,不仅具备干细胞的基本生物学特性,而且增殖稳定,可获得充足的细胞数量,有望成为组织工程的种子细胞来源。

^(153)Sm标记抗TPS单克隆抗体在荷人乳腺癌裸鼠体内的预定位显像

目的以153Sm标记的抗TPS单克隆抗体对荷人乳腺癌裸鼠进行肿瘤预定位显像的研究。为乳腺癌早期诊断提供一种新方法,并为其临床应用提供实验依据。方法实验Ⅰ组每只裸鼠预定位法从尾静脉注射7.4MBq/0.1ml标记抗体。实验Ⅱ组与Ⅲ组分别直接从尾静脉注射7.4MBq/0.1ml的135Sm-TPS及135Sm-IgG。并于于注射后2、4、8、24h行全身SPECT显像。于2、4、8、24h分批处死裸鼠并测定分别在肿瘤、血液、心脏、肺等重要脏器单位重量的放射性比值(%ID/g)。结果在运用预定位技术加药的实验I组在给药后2小时开始有抗体在肿瘤组织浓聚,在8小时时达到最高,与实验II组直接给予抗体比较,血液本底低,两组比较差异有显著性。(P<0.05)。结论应用预定位技术的实验组,瘤/血液比值高,血液本底低,周围正常组织吸收剂量低,显像效果好。