qRT-PCR检测柞蚕中肠热休克蛋白基因ApHSC70对微孢子虫入侵的响应

为证实柞蚕热休克蛋白在柞蚕防御体系中的作用,利用RT-PCR技术在柞蚕5龄幼虫中肠组织克隆了一个热休克蛋白基因Ap HSC70（Gen Bank登录号：KJ437496）,并通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测该基因在感染柞蚕微孢子虫的柞蚕中肠中的表达变化。该基因的开放阅读框（ORF）长1 959 bp,编码652个氨基酸,预测蛋白质分子质量为71.49 k D,等电点（p I）为5.38,具有细胞质特征基序,推测为一种组成型热休克蛋白;Ap HSC70与斜纹夜蛾、棉铃虫同源蛋白质的序列相似度最高,分别达96.94%、96.33%。感染柞蚕微孢子虫后0-9 h的柞蚕5龄幼虫中肠组织中,Ap HSC70基因转录水平变化不大,但感染后12 h该基因的转录水平开始升高,至感染后21 h达到最高值。研究结果表明,柞蚕中肠组织的Ap HSC70基因在柞蚕微孢子虫入侵时的表达变化呈现出一定的应激响应,表达量最高可上调近5倍,推测该基因可能参与了柞蚕的免疫防御过程。

栎黄掌舟蛾幼虫肠道好氧菌群分析及产纤维素酶菌的筛选

栎黄掌舟蛾Phalera assimilis是柞树主要叶部害虫之一。本研究以栎黄掌舟蛾幼虫为材料,从幼虫肠道中分离出好氧细菌23株,通过对16S r DNA扩增产物ARDRA分析后,代表性菌株测序结果表明,23株肠道好氧细菌分别属于葡萄球菌属Staphylococcus sp.、短小杆菌属Curtobacterium sp.、赖氨酸芽孢杆菌属Lysinibacillus sp.、肠球菌属Enterococcus sp.和阿特拉津降解菌属Arthrobacter sp.5个属的细菌,其中,以葡萄球菌属及短小杆菌属细菌种类最多。通过筛选培养基从23株菌中筛选出产纤维素酶菌6株。本研究可为深入了解栎黄掌舟蛾肠道菌群结构、寻找产纤维素酶菌及新的微生物资源等奠定了理论基础。

柞树叶与柞蚕蛹中的主要矿质元素及重金属元素含量测定

柞蚕及其饲料中的矿物质元素和有害重金属元素含量是科学评价柞蚕食品营养价值与实施产品生产质量监控的重要指标之一。在辽宁省6个市（县）选点采集柞蚕蛹和辽东栎柞树的叶片（采样柞蚕的饲料）,在沈阳市采集分属5个种的柞树叶片,采用HNO_3-H_2O_2高压消解-电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）对上述样品中的矿物质元素和重金属元素含量进行测定。方法学验证加标回收率为97.50%~102.60%,相对标准偏差（RSD）〈3.13%。对柞树叶样品的检测结果表明,同一地区各种柞树叶片中的矿物质元素含量存在差异,槲、麻栎2个种叶片中的重金属元素Mn、Fe、As、Hg、Pb含量较高;来自不同地区的辽东栎叶片中的矿物质元素含量存在显著性差异,其中Mg、P、K、Ca、Mn平均质量比分别为2 909.13、1 727.28、7 060.91、13702.74、514.66 mg/kg,Fe、Cu、Zn、Ni的平均质量比分别为280.11、15.48、22.75、5.19 mg/kg,Se的平均质量比为0.05 mg/kg,重金属元素Cr、As、Cd、Hg、Pb的平均质量比分别为1.52、0.30、0.09、0.02、2.63 mg/kg。检测不同地区来源的柞蚕蛹样品中的矿物质元素含量存在显著性差异,其中Mg、P、K、Ca平均质量比分别为3 725.74、8 019.68、15 102.84、1 234.52 mg/kg,Fe、Mn、Cu、Zn、Ni的平均质量比分别为120.15、14.80、16.64、132.06、2.82 mg/kg,Se的平均质量比为0.37 mg/kg,重金属元素Pb、Hg、Cr、As、Cd的平均质量比分别为1.63、0.01、5.01、0.92、0.32 mg/kg。相关性分析表明,柞树叶与柞蚕蛹中的Mn含量中度相关且相关性达到显著水平（P〈0.05）;柞树叶与柞蚕蛹中的P、K、Cr、Cu、Zn、As含量低度相关,Ni、Hg、Mg、Ca、Fe、Se、Cd、Pb含量在二者间的相关关系极弱。

2种柞树叶片和树皮中的挥发性化学成分鉴定

植物的挥发性成分具有多种生物活性功能。为了发掘和利用柞树资源的天然活性成分,采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析方法对辽东栎(Quercus liaotungensis)和麻栎(Quercus acutissima)叶片、树皮中的挥发性化学成分进行分析鉴定。在辽东栎和麻栎的叶片中分别鉴定出29、28种挥发性化学成分,在树皮中分别鉴定出23、27种挥发性化学成分。其中,辽东栎叶片中相对含量超过1%的组分包括4-羟基-4-甲基-2-戊酮、邻苯二甲酸二丁酯、叶绿醇、11,14,17-顺-二十碳三烯酸甲酯、己二酸二(2-乙基己)酯、1-二十醇和油酸酰胺,麻栎叶片中相对含量超过1%的组分有己二酸二(2-乙基己)酯、二十五烷、维生素E、4-羟基-4-甲基-2-戊酮、(1R)-(+)-CIS蒎烷、1-十六炔、叶绿醇、邻苯二甲酸二丁酯、9,12,15-十八烷三烯酸甲酯和油酸酰胺;在辽东栎树皮中相对含量超过1%的组分包括甘油脂肪酸酯、1-二十醇、二十七烷、反式角鲨烯、N-二十九烷、邻苯二甲酸二丁酯、二十烷、油酸酰胺、己二酸二异辛酯、二十五烷、十一烷、2,6-二叔丁基对甲酚和棕榈酸甲酯,麻栎树皮中相对含量超过1%的组分包括氰乙酸叔丁酯、叶绿醇、亚油酸、硬脂酸、十六碳酰胺、油酸酰胺、邻苯二甲酸二丁酯、己二酸二(2-乙基己)酯、1-二十二烯和角鲨烯。对上述检测到的挥发性化学成分进行分类,以酮类化合物、酯类化合物的含量较高,同时还检测到多种具有药用价值的成分如多不饱和脂肪酸、叶绿醇和角鲨烯等。同一树种不同部位检测到的挥发性化学成分的组成相近,但相对含量各异;不同树种的不同部位或同一部位之间检测到的挥发性化学成分的组成和含量都存在差异。

柞蚕微孢子虫孢壁蛋白基因NpSWP1的克隆及序列分析与原核表达

微孢子虫孢壁蛋白在侵染宿主的过程中发挥着重要作用。从已构建的柞蚕微孢子虫cDNA文库中筛选出一条孢壁蛋白基因的EST序列,并结合柞蚕微孢子虫感染柞蚕中肠的转录组数据设计特异性引物进行RT-PCR和3'-RACE扩增,克隆得到了一个柞蚕微孢子虫孢壁蛋白基因。该基因ORF长837 bp,编码278个氨基酸,蛋白质分子质量32.02 kD,等电点(pI)7.02。通过Blast比对分析,该基因与家蚕微孢子虫孢子内壁蛋白基因NbSWP1(GenBank登录号:EOB12097.1)的序列相似度为85%,二者编码的氨基酸序列相似度达79%,将该基因命名为NpSWP1(GenBank登录号:KJ573111),初步推测NpSWP1是一种孢子内壁蛋白。将NpSWP1基因与原核表达载体pEASY-E1连接,构建原核表达重组质粒并转化Transetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导5 h后,SDS-PAGE和Western blot检测重组菌液能够产生与预期结果相近的大小约32 kD的目的融合蛋白。研究结果有利于进一步开展NpSWP1的细胞定位和功能研究。

柞树单宁的提取及柞树品种间单宁含量的比较

本试验以辽东栎绿叶样品为材料,采用有机溶剂萃取法及分光光度法探讨了柞树单宁提取工艺,并对5种不同柞树品种的绿叶、落叶及枝条中单宁含量进行了比较。结果表明,选用80%乙醇(含1%盐酸)作提取剂,在料液比1∶15、提取时间2.5h、提取温度75℃条件下,单宁的提取量可达206.74mg/g;麻栎的单宁含量较高,绿叶期可达222.02mg/g,落叶期可达177.30mg/g,枝条单宁含量可达67.92mg/g,辽东栎、蒙古栎、锐齿槲栎及槲各有不同。