BACTEC系统对依赖利福平结核分支杆菌生长与耐药性的分析

目的 探讨依赖利福平结核分支杆菌 (依R菌 )在BACTEC系统中的生长特征 ,以便用该系统鉴定依R菌。方法 选取L -J法初步鉴定的依R菌 ,制成菌液 (10 -4 mg ml)分别以 0 .1ml接种于含不同利福平 (R)浓度 (1～ 384 μg ml)的 7H - 12液体培养基中培养 ,用BACTEC法测定不同实验瓶生长指数 (GI) ,判断耐药性 ,并对培养物称重及进行形态 (抗酸染色 )观察。结果 (1)耐药性 ,依R菌在R 1～ 96 μg ml 10个浓度中均耐药 ,R 192 μg ml临界 ,384 μg ml敏感。 (2 )菌体重量 ,R6、8、10、12、2 4 μg ml各瓶细菌重量 (分别为 87、12 5、116、10 4、6 5mg)明显高于对照瓶 (35mg) ,重量比为 1.9～3.6 ,平均 2 .9,其余各耐药瓶与对照瓶无明显差别。 (3)培养物涂片抗酸染色 ,可见各R瓶内结核分支杆菌菌体比对照瓶粗大、染色质深、染色颗粒明显 ,以R 8μg ml瓶最为典型。 结论 依R菌在含R(6～ 2 4 μg ml)环境中生长旺盛 。

43例肺科病人痰BACTEC法培养结核分支杆菌时污染菌种的分析

目的 探讨肺科病人痰BACTEC法培养污染菌种分布特点 ,以期更好地控制污染 ,降低污染率。方法 对 1997年 10月至 1999年 1月收治的 6 50例肺科病人痰标本BACTEC法培养污染标本 ,用常规普通细菌培养鉴定方法进行分离鉴定 ,并对结果进行分析。结果 6 50例肺科病人痰BACTEC法培养标本中 ,污染 4 3例 ,总污染率为 6 .6 % (43/ 6 50 )。对 4 3例污染标本进行普通细菌培养鉴定 ,共分离出 12种菌株 ,其中 4例培养出 2～ 3种菌株 ,共得 4 8株。以枯草杆菌和微球菌为主 ,分别为 16株 (33.3% ) ,9株 (18.8% )。另外 ,还分离出金黄色葡萄球菌 6株 (12 .5% ) ,白色念珠菌 3株(6 .2 % )以及革兰阴性杆菌 14株 (2 9.2 % ) ,且分为 7种细菌。结论 (1)实验室污染仍为主要污染源 ,应加强严格的无菌操作。 (2 )革兰阴性杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌共占到 4 7.9% (2 3/4 8) ,提示与肺部感染及口咽部病原菌污染有关[1] ,建议临床加强肺部炎症控制。

一线抗痨药物均耐药结核菌体外组合药物作用效果研究

目的对临床主要一线抗痨药异烟肼(isoniazidum,H)、利福平(rifampin,R)、链霉素(streptomycin,S)和乙胺丁醇(ethambatal,E)均耐药结核菌株进行体外组合药物作用效果研究,拟探讨结核病主要一线药物均耐药再联合用药时,化疗是否有效的临床耐多药结核病治疗问题。方法采用BacT/ALERT 3D分支杆菌培养系统对10株常规L-J法药敏至少对H、R、S和E(或同时对R)依赖的结核菌株及H37Rv标准敏感菌株,以MIC和平均血药峰浓度分别进行H、R、S及E单一药物和H+E+S及H+S+E+R组合药物药敏平行实验;将3D培养42d结果为阴性的实验瓶混悬液再平行转种于L-J管继续培养,以确定药物作用的效果(观察细菌是否真正被药物杀死)。结果单一药物3D法与L-J法的药敏结果基本一致。3D法单一药物均耐药菌株组合药物MIC和平均血药峰浓度实验结果显示不同程度报告阳性时间延长趋势。3D法单一药物耐药,组合药物未报告阳性的实验瓶,转种于L-J管继续培养均报告阳性。病例追踪10株分离株均为一线正规化疗失败的复治肺结核患者。结论小样本菌株实验研究结果提示:体外3D法H、R、S及E单一药物均耐药的临床结核菌株,组合药物(MIC和平均血药峰浓度)对其细菌可有不同程度的相对抑制作用,但没有最终协同杀灭细菌,其实验结果与患者临床疗效相符合。

rRNA扩增结核分支杆菌直接检测(MTD)的临床初步应用

目的:2000年全国第四次结核病流行病学抽样调查结果显示:我国约有500万结核病患者,5亿结核病感染者,结核病疫情仍然很严重.目前我国结核病疫情位居世界第二,重庆位居全国第二.……

临床依赖利福平分支杆菌的初步研究

目的 研究依赖利福平分支杆菌〔1〕(依R菌 )菌株的依R程度、菌落及菌体的形态特点 ,以期为依R菌的定义和鉴定提供依据。方法 从分支杆菌菌株库中选出在含R培养基中生长更旺盛的 2 2株菌株 ,用L -J氏培养基复苏培养。选取单个菌落接种不同R浓度的培养基中培养 ;对不同实验管 (对照管、R管 )中的菌落进行计数、称重、形态观察 ,并作抗酸染色观察菌体形态。结果 2 2株依R菌经菌种鉴定均为结核分支杆菌。依R菌对R的依赖性仅限于某个浓度范围 (R :5 0～6 0 0 μg/ml) ;不同的菌株其依赖范围不同 ,但大都在R10 0～ 30 0 μg/ml范围内生长最旺盛。依R管与非依R管 (对照管 )中菌落(菌体 )形态均有明显的差异 ,其菌落重量差为 2 .2～ 5倍。结论 目前我们所发现的依R菌株均为结核分支杆菌。依R菌对R的依赖为相对依赖。分支杆菌在含R培养基中菌落生长更旺盛和菌体粗大、浓染的特征 。

序列分析重庆地区耐利福平结核分支杆菌的rpoB基因突变

目的 研究重庆地区结核分支杆菌对利福平 (R)的耐受与rpoB基因突变的关系。方法 PCR扩增 6 7株分离自重庆地区肺结核患者的耐R结核分支杆菌的rpoB基因片段 (319bp) ;测定扩增片段的序列 ,并与野型株序列作对比分析。 结果 6 7株临床分离的耐R株中 ,8株 (12 % )无变异 ,5 9株 (88% )有突变 ,突变涉及 8个氨基酸位点。突变有 14种类型 ,4 9株(83% )的突变为单个密码子取代 ,9株为双密码子取代 ,1株为 3个碱基 (一个密码子 )插入 ,未检出碱基缺失。突变高发位点为 5 31位 (37/ 5 9)密码子 ,其次为 5 16位 (13/ 5 9)和 5 2 6位 (7/ 5 9)。 3株菌在 4 77位的谷氨酸 (Glu) ,天冬氨酸 (Asp)突变为首次发现。结论 重庆地区结核分支杆菌耐利福平的发生与rpoB基因的突变密切相关 ,突变的类型与国外的报告基本相似。PCR扩增和产物测序将是临床检测结核分支杆菌耐利福平和耐多药的一种迅速。

人MIF基因启动子多态性与结核病易感性的关系

为了研究巨噬细胞移动抑制因子(MIF)与结核病易感性的关系,分析了肺结核病人和正常人MIF基因启动子多态性。DNA测序分析的结果显示,正常人MIF基因启动子-794区CATT序列重复次数存在明显的差异,5、6和7个拷贝的几率分别是22.2%、44.4%和33.3%。7个肺结核病人中6人有6个拷贝,1人有7个拷贝,出现的频率分别为85.6%和14.3%。对比分析提示,肺结核病人MIF基因启动子区CATT低拷贝数(低于或等于6个)出现的频率明显高于正常人(85.6%比66.6%),可能同结核病的致病相关。

二种不同方法对结核菌培养和药敏的优势互补

目的 探讨二种不同方法对结核菌培养及药敏的优势互补。方法 收集我院临床痰标本 30 0份用 BACTEC法与改良罗氏法 (简称 L - J法 )分别对结核菌作初代培养 ,并收集 BACTEC法培养阳性菌 75株分别进行 BACTEC法和 L - J法的四种药敏(INH SM RFP EMB)试验。结果 初代培养 BACTEC法较 L - J法阳性率提高 17.3% ,阳性生长时间提前 2 3天。结论 结核菌初代培养可选择 BACTEC法 ,药敏试验选择 L - J法较好。

耐异烟肼结核杆菌Kat G463condon点突变的分子信标快速检测

目的应用分子信标探针检测结核杆菌耐异烟肼kat G463condon点突变,并与测序结果比较以验证该检测方法。方法运用软件对Beacon designer设计,katG基因包含463condon的分子信标,建立其扩增体系及分子信标芯片检测方法;对扩增产物测序并作比较。结果通过CDC相机观测到结核标准株及耐异烟肼PCR产物与分子信标杂交后荧光信号区别明显;16株耐异烟肼组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐异烟肼组463condon突变检出率为37%,分子信标检测方法与测序法符合率达93%。结论分子信标技术是一种具有高灵敏核酸点突变检测技术;分子信标芯片检测方法与测序法符合率较好。

单侧延长臂分子信标探针芯片在结核杆菌检测中的运用研究

目的分子信标探针在芯片表面的固定结合是限制其在芯片技术领域运用的难题。本研究拟寻找一种将分子信标探针固定在芯片表面的新方法,同时对其中重要影响因素进行优化探讨。方法本实验设计一种带单侧延长臂分子信标探针,固定在芯片表面进行杂交、扫描等后续实验。提高杂交效率部分优化包括:分子信标探针浓度;杂交温度、杂交时间;杂交液配方;4种分子对分子信标荧光信号比较。结果较理想区分阴阳性信号强度理想的探针浓度:Cy3-BDH分子信标探针浓度约10μmol/L,FAM-DABCLYE约15μmol/L。讨论单侧延长臂分子信标特异性高、敏感性高、技术难度低,对中、高密度芯片杂交可做到“点对点杂交”。

结核分枝杆菌H_(37)Rv株Rv0341编码基因iniB的克隆与表达

目的克隆并表达编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因。方法利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增iniB基因,克隆于pET-22b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性。结果克隆并表达了iniB基因,表达的蛋白相对分子质量约43000,诱导2h表达量较高,约为25%。目的蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化后蛋白纯度可达98%以上。经Western blot检测,纯化蛋白与依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)肺结核患者血清呈现强阳性反应,而与非依R菌肺结核患者血清不反应。结论已成功克隆并表达了编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因,表达的重组蛋白具有反应原性及特异性,为依R菌结核病临床血清学快速诊断方法的建立及试剂盒的研发奠定了基础。

三种方法用于耐多药肺结核患者菌种初步鉴定的比较分析

目的分析临床分枝杆菌培养阳性的耐多药肺结核患者三种初步鉴定结核菌种方法的准确度,期望为临床结核病实验室初步菌种鉴定技术的有效运用提供参考。方法收集重庆市公共卫生医疗救治中心结核内科2013年7月15日至2014年1月14日期间162例临床明确诊断为耐多药肺结核患者的实验室检查数据,统计三种方法(方法一:噻吩-2-羧酸肼(TCH)和对硝基苯甲酸(PNB)试验方法二:胶体金法定性检测MPB64抗原,方法三:分枝杆菌分型鉴定)菌种初步鉴定结果,分析检测结果的敏感性,采用卡方检验,以P<0.05为差异,具有统计学意义。结果以临床诊断结果为标准,三种方法鉴定结核分枝杆菌的敏感性,为93.8%(152/162),95.7%(155/162),96.3%(156/162)(P>0.05)。以方法三为标准,方法一和方法二鉴定结核分枝杆菌的敏感性分别为93.8%(150/156),95.7%(154/156)(P<0.01);鉴定非结核分枝杆菌的敏感性分别为50%(1/2),100%(2/2)。结论三种方法均可用于耐多药肺结核患者菌种的初步鉴定,使用胶体金法定性检测MPB64抗原法更方便、更省时。

重庆地区耐多药结核分枝杆菌基因分型特征分析

目的对重庆地区耐多药结核患者结核分枝杆菌进行基因分型,明确该地区基因类型的特征和流行情况。方法连续收集重庆市公共卫生医疗救治中心和重庆市第十二人民医院结核内科2013年7月至2015年3月753例临床诊断为耐多药结核患者的痰液或其他体液,采用液体培养法分离培养分枝杆菌,采用PCR方法对分枝杆菌分离株进行菌种鉴定,并使用多位点数目可变串联重复序列分析(multiple locus variable number of tandem repeat analysis,MLVA)方法进行基因分型。采用Bionumerics Version 3.0和phyloviz软件进行各基因位点的多态性和成簇分析。结果共分离培养出538例耐多药分枝杆菌菌株,经PCR鉴定确认结核分枝杆菌有503例(95.8%),非结核分枝杆菌有35例(4.2%)。北京家族型470例(93.4%,470/503),非北京家族型33例(6.6%,33/503)。503例分枝杆菌菌株共分为348个基因型,其中267例患者分离株为单一基因型,其余236例菌株可归入81个簇,成簇率为30.8%。北京家族型有76个簇,成簇率为30.8%,成簇比例为35.9%,非北京家族型有5个簇,成簇率为30.3%,成簇比例为33.3%。不同特征的耐多药结核人群对结核分枝杆菌北京基因型菌株易感因素分析:感染北京基因型菌株与性别无显著性关联(χ~2=2.68,P>0.05);与年龄呈显著性关联(χ~2=784.00,P<0.05)。结论重庆地区耐多药结核分枝杆菌的基因型存在明显的多态性,北京基因型占绝对优势;不同特征耐多药结核人群感染北京基因型菌株与性别无关,与年龄相关。

重庆地区耐多药结核患者抗结核药物敏感性试验特征初步分析

目的分析重庆地区耐多药结核病患者抗结核药物的特征,预期为临床药物的选择和耐多药结核病防治规划的完善提供科学依据。方法连续收集重庆市公共卫生医疗救治中心和重庆市第十二人民医院结核内科2013年7月16日至2015年3月11日期间753例临床诊断为耐多药结核病患者的体液标本,采用液体培养法分离培养分枝杆菌,对结核分枝杆菌分离株进行比例法药物敏感性试验,并与全国2007-2008年结核病耐药基线调查结果相比较。采用SPSS 13.0分析软件进行统计学分析,卡方检验以P<0.05为差异具有统计学意义。结果 1.共分离培养出538例分枝杆菌菌株,经鉴定确认结核分枝杆菌有503例,占95.8%(503/538),非结核分枝杆菌有35例。2.503例耐多药结核患者菌株药物敏感性试验结果显示:MDR有428例,XDR有75例。仅对INH和RFP耐药的菌株有34例,仅对一线抗结核药物耐药的菌株有61例,且两种耐药谱在初治与复治分类有显著差异(P值均<0.05)。初治与复治耐多药结核患者在"31-40"和"41-50"年龄组人数分布有显著差异(P<0.05)。EMB耐药率远低于全国2007-2008年结核病耐药基线调查结果。结论重庆地区大部分耐多药结核患者对多数二线抗结核药物耐药,要加强防控,以免进一步发展为广泛耐药患者。对31-50岁左右的初治耐多药结核患者选择用药方案需慎重,以免初治失败。EMB耐药率较低,在重庆地区用于治疗培阳耐多药结核仍有很大的临床抗结核价值,但需予以关注,谨防产生耐药。

痰中耐药结核分枝杆菌katG基因的快速检测及异烟肼耐药机制研究

目的快速检测痰中耐药结核分枝杆菌katG基因及了解耐异烟肼的分子机制。方法用PCR方法直接从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增katG基因片段,对扩增获得的katG基因片段进行序列测定,比较分析耐多药、全耐、多耐药但对异烟肼敏感、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异。结果于6 h内从耐药肺结核痰中快速检测到katG基因。从临床分离菌株中随机扩增药敏试验证实的耐多药3株,全耐、包括对异烟肼耐药的多耐、对异烟肼敏感的多耐药、全敏感及H37Rv标准结核分枝杆菌株各1株,均扩增获得273bp片段,序列测定比较发现,2株耐多药菌、1株全耐菌及包括异烟肼耐药的多耐药菌株均检测有katG基因点突变,突变位点均为第2066位碱基C突变为G,1例MDR-TB、全敏感株、对异烟肼敏感的多耐药菌株和标准株均无基因突变。结论PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌katG基因及其突变,结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性与katG基因点突变有关,但可能还存在其它值得探讨的机制。

痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因的快速检测及利福平耐药机制研究

目的快速检测痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因,了解利福平耐药的分子机制。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物,用PCR方法从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增rpoB基因片段,对扩增获得的rpoB基因片段进行序列测定,比较分析耐多药、全耐、单耐利福平、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异。结果于6 h内从耐药肺结核痰中快速检测到rpoB基因。耐多药菌株、全耐及单耐利福平分离菌株均检测有rpoB基因点突变,突变位点主要为531、516或526常见密码子,且绝大多数为单碱基突变,发现1例MDR-TB出现479位和531位密码子同时突变。敏感株和标准株无基因突变。结论PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌rpoB基因及其突变,结核分枝杆菌对利福平的耐药性与rpoB基因点突变有关。

痰耐药结核分支杆菌rpsL基因的快速检测及链霉素耐药机制研究

[目的]快速检测痰耐药结核分支杆菌rpsL基因及了解链霉素（SM）耐药的分子机制。[ 方法]用PCR方法直接从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增rpsL基因片段，对扩增获得的rpsL基因片段进行序列测定，比较分析全耐、对SM耐药的耐多药、对SM敏感的耐多药、全敏感或标准结核分支杆菌株之间的基因序列差异。[结果]于6h内从耐药肺结核痰中快速检测到rpsL基因。从所有临床分离菌珠均扩增获得267bp片段，序列测定比较发现，全耐菌和对SM耐药的MDR—TB菌株均检测有rpsL基因点突变，突变密码子为CCT突变为CTT，而全敏感株和标准菌株均未检测到基因突变。其中从一株对SM敏感的MDR-TB中也检测到突变。[结果]PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分支杆菌rpsL基因及其突变，结核分支杆菌对EMB的耐药性与rpsL基因点突变有关。

结核分枝杆菌Rv0341蛋白编码基因iniB的多态性分析

目的研究结核分枝杆菌假设蛋白Rv0341编码基因iniB的多态性,确认其保守性,分析依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)在利福平(R)培养管中Rv0341高表达的可能原因。方法用大肠埃希菌做为阴性对照,提取依R菌(14株)、耐R菌(23株)、R敏感的结核分枝杆菌(12株)、结核分枝杆菌标准株H37Rv及BCG(共51株)的细菌基因组DNA,利用PCR自基因组DNA中扩增iniB基因,通过ApaⅠ/EcoRⅤ、KpnⅠ/SmaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳检测其带型,对iniB基因进行限制性片段长度多态性分析并测序。结果实验组中iniB基因的酶切图谱完全相同,测序结果亦证实iniB基因无突变。结论 iniB基因在对R依赖、耐药和敏感等不同类型的结核分枝杆菌中是相对保守的;依R菌在Rv0341蛋白表达方面的差异可能是RNA转录差异或利福平诱导的结果。