二甲基砷酸对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的毒性作用以及诱导细胞凋亡的机制

旨在用类金属毒性物质——砷对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的染毒试验,探索砷对绒山羊皮肤成纤维细胞毒性作用和其诱导细胞凋亡的机制,为后续研究砷对绒山羊皮肤细胞生长的影响提供理论依据。本研究随机选取1只7月龄各项机能正常,体重为25 kg左右的雄性辽宁新品系绒山羊,取其腹部皮肤,进行细胞培养。将二甲基砷酸药物配制成11个不同浓度组(0、0.1、0.2、0.4、0.8、1、5、10、25、50、100 mmol·L^(-1)),对细胞量为3×10^(4)个·mL^(-1)皮肤细胞进行药物染毒24、48、72、96 h后,经MTT法进行3次重复试验,得到绒山羊皮肤成纤维细胞的增殖与抑制情况以及后续试验所选用的时间点和4个浓度组(对照、促进、临界、半抑制浓度(IC50)),进一步借助免疫荧光检测观察细胞骨架形态变化;彗星试验检测细胞DNA损伤情况;流式细胞仪检测细胞凋亡;透射电镜观察细胞质与细胞器的变化;测定细胞内荧光染料Mito-Tracker Green的染色强度分析线粒体跨膜电位(ΔΨm)以及观察分析溶酶体的数量情况。结果,24 h时不同浓度的OD值均能明显地反映出二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞的增殖和抑制趋势,而48、72、96 h时增殖作用逐渐减弱甚至消失,24 h时细胞增殖与抑制效果最佳,因此选取24 h时的对照组(未做任何处理)、促进浓度组(0.8 mmol·L^(-1))、临界浓度组(1 mmol·L^(-1))、IC50浓度组(38.68 mmol·L^(-1))进行后续的试验。24 h时,剂量范围0.1~1 mmol·L^(-1)的二甲基砷酸促进绒山羊皮肤成纤维细胞增殖,此阶段细胞骨架形态完整,细胞DNA未出现拖尾现象,凋亡率较小,线粒体数目增多,膜结构清晰,嵴致密,形态完整,膜电位升高,溶酶体数量增多;浓度大于1 mmol·L^(-1)的二甲基砷酸抑制绒山羊皮肤成纤维细胞生长,引起明显的细胞毒性(P<0.01),此时细胞骨架形态发生改变,DNA未出现拖尾现象,凋亡率显著上升,线粒体发生肿胀,形态不规则,嵴断裂溶解,膜电位降低,溶酶体数量减少。IC_(50)组细胞骨架形态差异很大,细胞DNA出现彗星尾,最多最明显(P<0.01),细胞凋亡数目明显增多,膜电位明显降低(P<0.01),溶酶体数量显著下降(P<0.01)。本研究探索了二甲基砷酸对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的毒性作用以及诱导细胞凋亡的机制,表明一定浓度的二甲基砷酸对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞具有毒性作用,并具有进一步诱导细胞凋亡作用。

亚砷酸钠对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的毒作用分析

该研究将辽宁绒山羊作为一种新的砷染毒动物模型来探究亚砷酸钠对其皮肤成纤维细胞的毒性作用,为砷影响绒山羊皮肤成纤维细胞的毒性效应及毒理作用机制提供理论依据。实验中采用不同浓度(0~120 μmol/L)的亚砷酸钠对绒山羊皮肤成纤维细胞分别染毒24、48、72、96 h。通过MTT法检测各实验组亚砷酸钠对细胞增殖与抑制的影响;用免疫荧光、透射电镜观察细胞骨架、细胞质与细胞器的变化;用彗星实验检测DNA损伤;用流式细胞仪检测细胞凋亡及溶酶体和线粒体的变化。研究发现在处理时间为24 h和48 h时,剂量范围为0~5 μmol/L的亚砷酸钠能促进绒山羊皮肤成纤维细胞增殖,5~120 μmol/L浓度的亚砷酸钠会引起细胞毒性和基因毒性;72 h和96 h时各浓度亚砷酸钠始终对细胞生长表现出抑制作用。当处理时间为24 h时,亚砷酸钠已经对细胞表现出明显的毒物兴奋效应,因此,该文选取24 h为亚砷酸钠染毒辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的最佳处理时间。低水平(0~5 μmol/L)亚砷酸钠处理细胞时,此时细胞骨架形态均匀且细胞骨架中微管蛋白聚合,活细胞数目增多,细胞器完整,线粒体膜电位升高,溶酶体数量增多;高水平(5~120 μmol/L)亚砷酸钠处理细胞时,细胞骨架形态差异较大,微管蛋白荧光明显减弱,细胞器损伤、DNA损伤严重、细胞凋亡数目明显增多,溶酶体活性和线粒体膜电位(ΔΨm)降低,表明亚砷酸钠诱导的绒山羊皮肤成纤维细胞凋亡机制可能与溶酶体和线粒体途径相关。该研究得出亚砷酸钠对绒山羊皮肤细胞的毒性作用呈"剂量–时间效应"关系,即作用时间为24 h时,低浓度的亚砷酸钠会促进细胞增殖,且对细胞生长起促进作用的最佳浓度为0.5 μmol/L,然而亚砷酸钠(>5 μmol/L)会引起绒山羊皮肤成纤维细胞的细胞毒性与基因毒性。