以beta-tubulin基因为选择标记的淡紫紫孢菌遗传转化

[目的]建立稳定的食线虫真菌淡紫紫孢菌遗传转化体系,并获得插入突变体。[方法]介导的方法,以淡紫紫孢菌20-7的分生孢子为受体,将新构建的携带beta tubulin基因的质粒转化进入淡紫紫孢菌的细胞中,通过优化诱导乙酰丁香酮(AS)的浓度、诱导培养时间、农杆菌终浓度OD660值、共培养AS的浓度、共培养时间和共培养温度等因子,建立高效遗传转化体系,获得致病力不同的突变体。[结果]共培养过程中使用萌发孢子是成功建立淡紫紫孢菌遗传转化体系的必要条件;淡紫紫孢菌萌发的孢子与农杆菌EHA105在25℃共振荡培养48 h时,且在共培养阶段当乙酰丁香酮浓度为200μg·mL^(−1)(pH5.5)时转化效率最高,转化效率为1200~3200个转化子/106分生孢子,阳性抗性转化子比率为96%;转化子PCR表明,T-DNA已整合到淡紫紫孢菌的基因组中;Southern杂交验证表明,83.3%的转化子为T-DNA单拷贝插入;成功建立了可靠的淡紫紫孢菌的遗传转化体系,并从20个转化子中筛选到16个致病力变异的突变体。[结论]本研究成功构建了农杆菌介导的、以beta-tubulin基因为选择标记的淡紫紫孢菌高效遗传转化体系,并获得致病力变异的插入突变体,为淡紫紫孢菌的基因功能、致病机制研究及优良菌株选育奠定了基础。

松褐天牛球孢白僵菌高毒力航天诱变菌株的筛选

【目的】松褐天牛Monochamus alternatus是我国松材线虫病Bursaphelenchus xylophilus的主要媒介昆虫。为了更好地开发利用松褐天牛病原微生物球孢白僵菌Beauveria bassiana,本研究通过航天搭载诱变及室内筛选,获得球孢白僵菌高毒力诱变菌株。【方法】将经神舟八号飞船航天搭载诱变后的孢子稀释液涂布在PDA平板上培养,获得单菌落菌株,进而筛选获得高毒力诱变菌株。观察所获9个航天诱变菌株的菌落形态、菌落生长速度、产孢量、孢子萌发率及抗高温胁迫能力等生物学特性,在此基础上筛选出生物学性状优良的菌株B159,B252和B305,并进一步对松褐天牛4龄幼虫进行生物测定。再通过撒菌粉和注射菌液方法,检验B252和B305对松木段内松褐天牛幼虫的杀虫效果。【结果】球孢白僵菌航天诱变菌株的生物学特性与野生型菌株cfcc81357存在分化。9个航天诱变菌株的菌落形态发生了不同程度的改变,6个菌落生长速率出现负向变异,仅诱变菌株B159,B252和B305能产生分生孢子。航天诱变菌株B252和B305在浓度为1.0×107cfu/m L时对松褐天牛4龄幼虫的校正死亡率均为100%,半致死中时(LT50)分别为8.08和8.56 d,明显优于野生型菌株,显示出对松褐天牛的极强毒力。使用撒菌粉和孢子液体注射方法,诱变菌株B252和B305对松木段内松褐天牛幼虫死亡率比野生型菌株高。【结论】诱变菌株B252和B305可能是优良菌株,对生物防治松褐天牛方面有潜在的实用价值。

松材线虫病发生及防控现状

松材线虫在20世纪30年代就由美国的Steiner和Buhrer作为新种报道,但直至1971年才在日本被确认是引起松树枯死的原因。目前松材线虫在世界上分布还不很普遍,但对世界松林构成严重威胁。本文介绍了松材线虫发生及防控现状,着重介绍了松材线虫在世界的分布、寄主植物、传媒昆虫及管理现状。针对我国松材线虫病的发生和防控现状,探讨了我国松材线虫病防控对策和提出展望。

根癌农杆菌介导的淡紫拟青霉遗传转化体系的建立

基于根癌农杆菌介导的遗传转化方法,选择植物线虫生防真菌淡紫拟青霉的分生孢子为受体,建立以G418为筛选标记遗传转化体系。通过优化遗传转化条件,达到较高的转化效率:1000～2400个转化子·10-6分生孢子。对转化子进行PCR验证,表明T-DNA已整合到淡紫拟青霉的基因组中,表型测定发现转化子的遗传表现稳定。农杆菌介导淡紫拟青霉突变体库的建立,为进一步筛选对植物线虫致病性高的突变体、了解淡紫拟青霉的侵染过程和侵染机制提供基础,对培育更优良的植物线虫生防菌株,开发高效生防制剂等具有重要的意义。

淡紫拟青霉航天诱变菌株对南方根结线虫的致病力

[目的]为筛选对南方根结线虫具有高致病力的淡紫拟青霉航天诱变菌株,通过淡紫拟青霉山东寿光菌株搭载神舟八号获得10个淡紫拟青霉航天诱变菌株。[方法]以这10个航天诱变菌株对南方根结线虫卵进行寄生试实验,观察了其发酵液对南方根结线虫卵及二龄幼虫的作用,并对与毒力相关的胞外酶几丁质酶和蛋白酶活性进行了测定。在此基础上,通过盆钵试验方法,检验菌株Sd-m-9、Sd-m-16和Sd-m-26对花椒南方根结线虫的防治效果。[结果]结果表明:10个诱变菌株对南方根结线虫卵的寄生率与原始菌株存在分化,其中有3个诱变菌株的寄生率增强,即Sd-m-9、Sd-m-16和Sd-m-26;这10个诱变菌株的几丁质酶和蛋白质酶的活性与对南方根结线虫卵的寄生率之间呈正相关。在盆钵试验中,菌株Sd-m-9、Sd-m-16和Sd-m-26对南方根结线虫的根结指数较原始菌株下降88.34%89.70%。[结论]因此,航天诱变菌株Sd-m-9、Sd-m-16和Sd-m-26可用于对南方根结线虫的防治。

安徽省3种中草药植物的根结线虫种类鉴定

白术、白芷和桔梗是3种重要的药用植物,它们的根茎有很高的药用价值。安徽省亳州市白术、白芷和桔梗这3种中草药植物种植田中发现有植株感染根结线虫病。为了明确感染这3种中草药的根结线虫种类,通过根结线虫雌成虫的会阴花纹、同工酶及分子生物学检测(rDNA-ITS区、28S rD2/D3区和rDNA-IGS区)进行了根结线虫种类鉴定。白术和白芷的根结线虫鉴定为花生根结线虫;桔梗的根结线虫鉴定为南方根结线虫。这是中国首次报道在白术和白芷上发现花生根结线虫病。这个结果为这3种中草药的根结线虫病防治提供了依据。

四川省茂县花椒根结线虫病病原鉴定

为明确四川省茂县花椒根结线虫的种类,通过根结线虫雌虫和2龄幼虫的形态特征及雌成虫的会阴花纹、雌虫酯酶同工酶及分子生物学检测(rDNA-ITS区和rRNA-IGS区),对花椒根结线虫进行了种类鉴定。三种方法的结果均表明在茂县地区花椒上发现的根结线虫为北方根结线虫(Meloidogyne hapla),这是我国首次报道在花椒上发现北方根结线虫病,四川省是北方根结线虫新的分布区。

淡紫拟青霉液体发酵条件的优化

【目的】对食线虫真菌淡紫拟青霉液体培养条件进行优化,从而获得优化的淡紫拟青霉液体发酵条件。【方法】研究淡紫拟青霉在不同碳源、氮源、无机盐、初始pH值下对产孢量的影响,确定了适宜的培养条件及发酵培养时间。【结果】最佳基础培养基配方为A1(g/L):葡萄糖40,NaNO320,KH2PO40.5,MgSO4.7H2O 0.5;最佳复合培养基配方为b(g/L):葡萄糖40,NaNO310,(NH4)2SO45,黄豆粉5,KH2PO40.5,MgSO4.7H2O 0.5;其他培养条件的选择结果:淡紫拟青霉最适产孢的初始pH值为6.0～7.0,发酵温度26℃,发酵培养时间为72h到80h。【结论】通过这些研究获得了淡紫拟青霉液体优化的发酵条件,为该菌大规模产生奠定基础。

厚垣普可尼亚菌液体发酵动力学

厚垣普可尼亚菌是对植物线虫有防治潜力的生防菌。利用正交设计优化厚垣普可尼亚菌液体发酵条件,利用Grow/Sigmoidal模型中的非线性拟合方程Logistic函数和Boltzmann函数构建该菌液体发酵过程中的孢子增长、底物消耗和产物生成的液体发酵动力学模型,并运用Origin Pro V8.6软件拟合求解出各模型参数。结果表明:在28℃条件下和500 mL摇瓶中,厚垣普可尼亚菌优化培养基及培养条件是葡萄糖15.0 g·L-1,玉米粉15.0g·L-1,大豆粉20.0 g·L-1,KH2PO40.25 g·L-1,MgSO4·7 H2O 0.25 g·L-1,接种量5%,初始pH 5.0,装量40%和转速190 r·min-1。厚垣普可尼亚菌液体发酵动力学模型可描述发酵过程中孢子含量、还原糖和氨基氮浓度随时间的变化规律,并对碳氮代谢进行分析。模型能够较好地拟合发酵过程:孢子量比生长速率在88.1 h时达到最大,最大值为0.030 2 h-1;还原糖比消耗速率在86.8 h时达到最大,最大值为0.033 4 h-1;氨基氮比生成速率在110.8 h时达到最大,最大值为6.864×10-4h-1。模型拟合和试验数据具有良好的适应性,可反映普可尼亚菌液体发酵过程的动力学特征,为其大规模生产奠定基础。

淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白酶活性及致病力的变化

【目的】明确食线虫真菌淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白酶活性和致病力的改变。【方法】测定淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白酶活性,及对南方根结线虫的致病力,分析它们与致病力的相关性。【结果】结果表明:14个淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶活力和蛋白酶活力由于T-DNA的插入均受到了不同程度的影响。对南方根结线虫卵的寄生率与原始菌株也存在分化,筛选获得了1株致病力增强的突变体BN-11和11株致病力明显下降的菌株;通过分析,这14个淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白质酶的活性与寄生率之间不呈正相关性。【结论】获得了淡紫拟青霉T-DNA插入突变体几丁质酶和蛋白质酶的活性与致病力变化的证据,有助于淡紫拟青霉致病机制分析及致病相关基因的克隆。

葡萄籽原花青素对秀丽隐杆线虫抗衰老的影响

以秀丽隐杆线虫作为模型,研究了葡萄籽原花青素(grape seed procyanidins,GSP)对线虫寿命、生殖能力和运动能力的影响,进行了热应激和氧化应激实验,探讨了原花青素影响线虫衰老的方式。结果表明:当原花青素浓度分别为100、200、300μg/mL时,与对照组相比,采用200μg/mL原花青素喂养秀丽隐杆线虫,线虫的平均寿命延长了25.7%(p<0.01),最大寿命延长了24.0%(p<0.01),线虫的运动能力增强,平均每天每分钟爬过的峰数延长了13.2%(p<0.05),可以作为喂养秀丽隐杆线虫的最佳剂量。与对照组相比,采用200μg/mL原花青素饲喂线虫,线虫的产卵高峰期延迟,但对产卵量总数和孵化率无显著影响;热应激胁迫中,线虫的平均生存时间显著延长了27.3%(p<0.01);氧化应激胁迫中,线虫的平均生存时间延长了11.2%(p<0.05)。结论:饲喂葡萄籽原花青素可以改善线虫的平均寿命,且主要是通过提高线虫的压力应激能力来延缓秀丽隐杆线虫的衰老。

链格孢属真菌的分子复核鉴定及系统发育研究

为了验证中国林业微生物保藏管理中心库藏链格孢属(Alternaria Nees)菌种资源分类地位的准确性,探索一种链格孢属真菌的快速复核鉴定方法,采用ITS序列分析、NCBI blast以及系统发育分析等方法,对中国林业微生物保藏管理中心库藏链格孢属的36个种及未定种的375个菌株进行分子复核鉴定以及系统发育关系研究。结果表明:研究的375个菌株中,有21个菌株的分类地位不准确,其中有9株菌的ITS序列与链格孢属菌种的同源性在92%～96%之间,另外12株菌的ITS序列与链格孢属菌种的同源性在60%～85%之间。基于ITS序列构建的NJ树显示,29个小孢子种的37个生物型形成了一个稳定的分支,而6个大孢子种与外群Ulocladium sp.聚在一个分支。本研究中,ITS序列分析可以用来区分和鉴定形态差别明显的大孢子种,但无法区分亲缘关系较近的29个小孢子种。

淡紫拟青霉T-DNA插入突变体的表型分析

研究淡紫拟青霉T-DNA插入突变体,鉴定突变体的表型特征,为淡紫拟青霉致病机制分析及致病相关的基因克隆奠定基础。PCR检测筛选的14株T-DNA插入突变体,观察和测定菌落形态,菌落生长速率,产孢量,孢子萌发率和菌丝干质量等生物学性状,并比较突变体致病力。结果表明突变体均含有beta-tubulin基因序列,T-DNA已整合进入野生型菌株20-7的基因组中。通过与野生型菌株对比,发现突变体菌落形态发生了不同程度的改变。菌落生长速率明显增大的菌株占全部菌株的85.71%,只有BN-11菌株的菌落生长速率降低。产孢量显著变大的菌株有BN-11和BN-12,为菌株总数的14.29%。孢子萌发率发生改变的菌株占78.57%。菌丝干质量发生明显增大和减少的菌株都占全部突变体的21.43%。筛选获得了1株致病力增强的突变体BN-11和11株致病力显著降低的突变体。

一种适于PCR和LAMP检测的松木中松材线虫DNA快速提取方法

【目的】本研究旨在探索快速、简便地直接从病木中提取松材线虫DNA的方法。【方法】运用Chelex-100结合异硫氰酸胍蛋白变性缓冲液建立新的高效快速提取微量木块中线虫DNA的方法,并通过普通PCR与环介导等温扩增(LAMP)对提取的DNA进行检测验证。【结果】建立了提取线虫DNA的新方法 Chelex-100法,并对影响提取效率的Chelex-100浓度、冻融时间和煮沸时间进行了优化。Chelex-100法最适Chelex-100终浓度为1.5%(W/V),最适冻融时间为5 min,最适煮沸时间为8 min。与传统的CTAB法和蛋白酶K法比较,Chelex-100法提取的DNA得率高,相同条件下,该方法提取的DNA浓度远远大于常规方法。3种方法的OD260/280比值从大到小依次为CTAB法>蛋白酶K法≥Chelex-100法,Chelex-100法的OD260/280值显著低于CTAB法,而略低于或等同于蛋白酶K法,但这并不影响对提取的DNA进行PCR扩增。采用Chelex-100法提取松木中松材线虫的DNA,结合常规的PCR和LAMP检测,检测灵敏度高,特异性强,稳定性好;提取的松材线虫DNA的75倍稀释液再稀释32倍后进行PCR扩增,扩增产物电泳依然有清晰的条带。用新方法提取病木中线虫的DNA后进行检测,所有带病松木样品的检测结果均呈阳性,而健康黑松、马尾松、油松木屑及盘多毛孢样品的检测结果均呈阴性。此外,该提取方法简便快速,20 min内即可完成整个DNA的提取;经济方便,试剂保藏无特殊要求,单个样品提取耗费低于3.5元。【结论】Chelex-100法是一种快速有效的提取松木中松材线虫DNA的方法,此方法结合PCR和LAMP检测技术将进一步提高松材线虫的检测效率、灵敏度和准确性,可为松材线虫的野外检测提供可靠的技术依据。

马尾松抗性家系感染松材线虫后酶活性变化研究

采用紫外分光光度计法,测定马尾松枝条木质部过氧化氢酶、苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、多酚氧化酶活性并对其进行比较分析,从生理生化学角度揭示马尾松抗性家系抗松材线虫病的机制。结果表明:随着松材线虫的侵染,抗病家系的4种防御酶活性变化表现不同。其中,不同家系间过氧化氢酶活性差异均不显著;马尾松枝条接种松材线虫6 h后,组织中苯丙氨酸解氨酶活性达到最高值;过氧化物酶活性不同时间段的差异不显著,不同家系间差异极显著;在相同的时间,各马尾松抗性家系枝条中多酚氧化酶活性明显高于CK,在不同时间段,不同家系间,差异均极显著。因此,多酚氧化酶可作为马尾松抗松材线虫病早期鉴定的重要生理指标。

航天搭载淡紫拟青霉的生物学效应

为探讨航天诱变对淡紫拟青霉的生物学效应的影响,利用淡紫拟青霉山东菌株搭载"神舟八号"宇宙飞船进行诱变处理。对筛选得到的30个淡紫拟青霉航天诱变菌株进行了形态、色素、菌丝及孢子形态、菌落生长速度、菌丝干重和产孢量等生物学检测,并测定了各诱变菌株对南方根结线虫卵和松材线虫卵的寄生率。结果表明,淡紫拟青霉航天诱变菌株各项生物学特性与原始菌株存在分化。航天诱变后的菌株菌落形态、色素和菌丝结构与原始菌株差异明显;菌落生长速度、菌丝干重和产孢量的负突变率均高于正突变率;菌株对松材线虫卵的致病力较低,寄生率最高的菌株Sd-m-20的寄生率仅为18.0%,菌株对根结线虫卵致病力较高,菌株Sd-m-9,Sd-m-11,Sd-m-16,Sd-m-22和Sd-m-26对根结线虫卵的寄生率分别提高了14.48%、14.90%、12.35%、7.66%和17.45%,显著高于原始菌株的寄生率(78.3%)。航天处理对淡紫拟青霉诱变效果显著,其优良突变菌株可能用于淡紫拟青霉对南方根结线虫的生物防治。

梯度淋洗离子色谱法分离测定高氯水中的痕量NO_2^-

采用DionexOnGuardⅡAg柱、OnGuardⅡH柱及0.45μm过滤头串联处理高氯水样后直接进样分析,以KOH溶液为淋洗液进行梯度淋洗,分离、测定了高氯水中痕量NO2-。方法的回收率为97%~104%,检出限为0.01mg/L。

九叶青花椒根结线虫病的病原鉴定

为确定四川省蓬溪县九叶青花椒种植区发病植株花椒根结线虫的种类,进而为九叶青花椒根结线虫病防治提供依据,本文根据根结线虫雌虫与2龄幼虫的形态特征及雌成虫的会阴花纹、雌虫酯酶同工酶图谱,并结合特异性扩增及rDNA-ITS扩增,根据ITS序列构建系统发育树,对该地区九叶青花椒根结线虫病的病原进行了种类鉴定。结果表明该病原为南方根结线虫Meloidogyne incognita(Kofold&White)Chitwood。这是我国首次在九叶青花椒上发现南方根结线虫。

松材线虫对长白落叶松的致病性

【目的】研究松材线虫对长白落叶松的致病性,致病过程中的迁移运动和超氧化物歧化酶SOD的活性变化,为松材线虫对长白落叶松的致病机制研究及长白落叶松的松材线虫病害防控提供理论依据。【方法】以2年生盆栽长白落叶松幼苗为研究对象,人工接种辽宁清原株系(QH-1)、江苏南京株系(NM-1)与重庆株系(CM-1)松材线虫,每株接种2000条,分别于接种1、2、4、7、10、15与25天后在落叶松幼苗接种点上下进行等距(1.5 cm)茎段截取与茎段横截面病害观察,计数不同截取茎段线虫,统计分析不同株系松材线虫在落叶松幼苗内的移动能力,同时接种后1-7天分别对接种幼苗叶片取样,用于SOD活性变化分析。接种35天后统计接种幼苗发病率与再分离线虫数量,结合不同株系松材线虫的移动能力与接种幼苗SOD活性变化,分析不同株系松材线虫对长白落叶松幼苗的致病性。【结果】QH-1、NM-1与CM-1均能导致2年生长白落叶松幼苗萎蔫,但接种QH-1的幼苗首次发病时间比NM-1和CM-1早5天。接种35天后,QH-1、NM-1和CM-1接种的长白落叶松幼苗的发病率分别为100%、70%和60%,感病指数分别为100、43.3与40。接种QH-1、NM-1和CM-1后的萎蔫幼苗中均可分离到松材线虫,平均每株线虫量分别为(23457±2862)条、(14090±2190)条与(15857±2079)条,差异显著(P<0.01)。QH-1、NM-1和CM-1接种长白落叶松后移动能力存在明显差异,其中QH-1移动能力强于NM-1与CM-1。QH-1、NM-1和CM-1接种长白落叶松幼苗后SOD活性变化趋势存在明显差异,其中QH-1处理组SOD活性上升幅度与下降幅度大于NM-1和CM-1处理组。横截面观察结果表明,在长白落叶松幼苗在接种QH-1、NM-1和CM-1后,QH-1对长白落叶松的破坏程度最重。【结论】辽宁清原、江苏南京与重庆株系松材线虫对2年生长白落叶松幼苗均具有致病性,其中辽宁清原株系松材线虫对长白落叶松幼苗致病性最强,江苏南京与重庆株系松材线虫对长白落叶松致病性低于辽宁清原株系。部分接种幼苗无明显病症但能分离到少量线虫,表明长白落叶松发病与否和树体内松材线虫的数量和移动能力有关。

厚垣普可尼亚菌航天诱变的生物学效应

为探讨厚垣普可尼亚菌航天诱变的生物学效应,对筛选得到的29个厚垣普可尼亚菌航天诱变菌株进行形态、色素、孢子形态、菌落生长速度、菌丝干重、产孢量和致病力等生物学特性检测,并测定各航天诱变菌株的耐盐性以及对苯菌灵的抗性。结果表明,厚垣普可尼亚菌航天诱变菌株各项生物学特性与原始菌株存在差异。航天诱变后的菌株菌落形态和色素与原始菌株差异明显;菌落生长速度和菌丝干重的负突变率均高于正突变率;产孢量的正突变率高于负突变率;菌株Pc-m-4、Pc-m-6、Pc-m-10、Pcm-15和Pc-m-123对南方根结线虫卵的寄生率分别为92.33%、93.67%、91.67%、90.67%和90.33%,显著高于原始菌株的寄生率(81.00%),其中,菌株Pc-m-6具有较好的苯菌灵抗性,菌株Pc-m-10对盐具有较好的耐受性。航天诱变处理对厚垣普可尼亚菌影响显著,其诱变后的优良菌株具有防治南方根结线虫的潜力。