pCAGGs-miR-483重组质粒构建及miR-483转基因小鼠模型的建立

miR-483是近年发现的一种编码于胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor2,Igf2)基因第2内含子的microRNA.研究表明,高脂饮食诱导的肥胖动物的心脏、肝脏及肝、肾肿瘤组织中miR-483表达异常,但其生物学功能尚待研究.建立稳定表达miR-483并能够传代的miR-483转基因小鼠是研究其功能的重要环节.利用特异miR-483克隆引物,以小鼠基因组为模版,经PCR获得pre-miR-483片段,通过重组构建pCAGG-miR-483重组质粒.该质粒可在真核细胞中稳定表达成熟miR-483.再利用原核显微注射法建立miR-483过表达转基因小鼠.利用实时PCR检测各组织miR-483含量.结果显示,miR-483转基因小鼠心肌、骨骼肌、肝脏等组织可过表达成熟miR-483.此外,miR-483转基因过表达小鼠较野生型小鼠体重降低,提示miR-483可能在发育、代谢等方面具有调节作用.miR-483转基因小鼠模型的建立为microRNA功能研究提供了在体研究的平台.

miRNA“海绵”重组质粒的构建及对miR-483-5p的敲减

目的建立microRNA失功能(loss of function)研究模型,为功能研究提供实验材料。方法针对miR-483-5p成熟体序列设计含6个拷贝反义序列的DNA片段,称为"S-483",将其连接入含CAG启动子的pCAGGs载体中,构建pCAGGs-S-483重组质粒。利用脂质体技术瞬时转染Hep1-6细胞,经re-al-time PCR对成熟miR-483-5p含量进行检测。结果转染pCAGGs-S-483组miRNA-483含量(0.33±0.04)较转染空质粒组(1.00)明显下降(P<0.01),但对其它miRNAs无影响。结论 S-483海绵策略可有效"吸附"并降低miR-483-5p,成功构建了pCAGGs-S-483重组质粒,为其功能研究和miRNA敲减动物的建立提供了有益借鉴。

miR-483过表达对小鼠记忆功能的影响

目的探讨miR-483过表达是否影响小鼠记忆功能。方法选取C57BL/6低龄(3月龄)及高龄(13月龄)的野生型及miR-483转基因鼠,进行新物体识别实验检测记忆能力。PCR筛选实验鉴定转基因阳性小鼠后,分析两种小鼠记忆能力的差异。运用实时定量PCR方法检测各组小鼠脑中miR-483表达水平,以及记忆相关分子在脑中的表达趋势。通过Western blot方法检测小鼠脑中记忆相关蛋白的表达水平。结果低龄转基因型小鼠与低龄野生型小鼠新物体识别次数差异具有统计学意义,低龄野生型鼠记忆能力更强;低龄转基因小鼠脑中细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)表达量高于低龄野生型小鼠。结论在低龄小鼠中,miR-483过表达导致记忆损伤,同时引起脑部ERK表达水平的上调。

周围神经侵犯与结直肠癌临床病理因素及预后的关系

目的 探讨周围神经侵犯（PNI）与结直肠癌临床病理因素及预后的关系。方法 回顾性收集2011年1月至2012年6月期间于哈尔滨医科大学附属第二医院结直肠肿瘤外科行根治性手术治疗的372例结直肠癌患者的临床病理资料及术后标本。病理标本经苏木精-伊红染色后，将肿瘤细胞侵犯神经鞘任意一层或肿瘤细胞沿神经生长包绕超过神经周径1/3定为PNI阳性。采用χ2检验或Fisher确切概率法分析PNI与结直肠癌临床病理因素的关系；绘制Kaplan-Meier生存曲线并采用Log-rank检验对PNI阳性与阴性患者的3年生存率进行比较。结果 全组372例结直肠癌患者共133例（35.8%）存在PNI阳性。其中PNI阳性患者中男性63例，女性70例；年龄〉 60岁者76例，≤60岁者57例；肿瘤位于回盲部6例，升结肠33例，横结肠7例，降结肠8例，乙状结肠22例，直肠57例；肿瘤直径〉 4 cm者83例，≤4 cm者50例；中高分化者48例，低分化者85例；肿瘤浸润深度T1期者2例，T2期者7例，T3期者93例，T4期者31例；淋巴结转移N0期者56例，N1期者41例，N2期者36例；肿瘤分期Ⅰ期者2例，Ⅱ期者40例，Ⅲ期者75例，Ⅳ期者16例。PNI阳性与肿瘤位置（χ2= 11.20，P= 0.048）、肿瘤大小（χ2= 21.80 ，P= 0.000）、分化程度（χ2= 60.90 ，P= 0.000）、浸润深度（χ2= 19.00 ，P= 0.000）、淋巴结转移（χ2= 19.70，P= 0.000）及肿瘤分期（χ2= 70.80，P= 0.000）有关，差异均有统计学意义，而与患者性别、年龄及脉管侵犯情况无关（均P 〉 0.05）。全组中位随访时间48 （8~ 62）月，PNI阳性患者的3年生存率为52.6%，明显低于PNI阴性患者的78.3%（P= 0.000）。进一步对Ⅱ期和Ⅲ期结直肠癌患者进行亚组分析显示，Ⅱ期和Ⅲ期PNI阳性患者的3年生存率分别为62.3％和43.5%，均明显低于Ⅱ期和Ⅲ期PNI阴性患者的91.7％和79.4%，差异均有统计学意义（均P= 0.000）。结论 PNI阳性可能提示结直肠癌患者的预后不良。Ⅱ期和Ⅲ期结直肠癌患者PNI状态的检测对判断预后有重要意义。