结核分枝杆菌耐热抗原(MTB-HAg)对γδ T细胞影响的研究进展

结核分枝杆菌耐热抗原(MTB-HAg)是从结核分枝杆菌(MTB)减毒菌株H37Ra经121℃,20 min,高温高压处理后从菌体释放到上清液中一种多肽类抗原。γδ T细胞是一类广泛分布于非淋巴组织的非常规T细胞,可分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)等细胞因子,在抗MTB感染的免疫应答中发挥重要作用。MTB-HAg可在体外有效刺激γδ T细胞增殖活化,使其更加高效地参与抗结核感染的过程,故MTB-HAg可作为设计新型结核疫苗或药物的潜在靶点。但由于MTB-HAg组成复杂,具体是何种成分刺激γδ T细胞发挥抗MTB感染功能还不清楚。

结核分枝杆菌GroES蛋白表达、纯化及其生物信息学分析

目的 将结核分枝杆菌H37Ra株GroES蛋白进行原核表达与纯化,并对其进行生物信息学分析。方法 通过PCR扩增GroES基因并克隆至pET28a中,测序鉴定后将pET28a-GroES转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导GroES蛋白表达,SDS-PAGE分析表达产物,镍亲和层析柱纯化重组GroES蛋白,Western blot鉴定GroES的免疫反应性。应用ORF Finder、ProtParam、TMHMM Server 2.0、NetPhos 3.1 Server、NetNGlyc1.0 Server、SignalP 4.1 Server、BLAST、Softberry、PSORT、Vaxijen、SOPMA、SWISS-MODE、ABC-pred、IEDB、SYFPEITHI、STRING工具对GroES的结构和功能进行生物信息学预测。结果 成功构建重组pET28a-GroES重组体,用ITPG诱导后GroES在大肠杆菌以可溶性形式表达,纯化后GroES纯度达90%,Western blot证实GroES具有免疫反应性。生物信息学显示GroES蛋白由100个氨基酸组成,分子式为C478H776N124O147S1,等电点为4.62,为亲水性蛋白,有9个磷酸化位点,无跨膜区及信号肽序列,其编码基因MRA-3458全长303bp,含1个开放阅读框;GroES二级结构中,α-螺旋占5%,β-折叠占37%,β-转角占8%,无规则卷曲占50%;预测GroES具有多种与之相互作用的蛋白质和潜在的T、B细胞表位。结论 成功表达和纯化具有免疫反应性的重组GroES蛋白,并预测了GroES结构与功能,提示GroES可作为制备结核疫苗或药物的候选蛋白,为更深入理解结核分枝杆菌的感染免疫机制奠定基础。

结核分枝杆菌PPE59蛋白的表达、纯化和生物信息学分析

目的:构建结核分枝杆菌pET28a-PPE59原核表达载体,异丙基-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达和纯化获得PPE59蛋白;同时对PPE59蛋白进行生物信息学分析,预测其可能结构和功能。方法:以H37Rv基因组为模板扩增获得PPE59基因,利用同源重组将其克隆至原核表达载体pET28a,后转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,采用Ni~+-NTA亲和层析柱对PPE59蛋白进行纯化,获得重组PPE59蛋白并进行鉴定。使用Protparam、NetPhos 3.1 Servera、ABCpred、SYEPEITHI等软件对PPE59蛋白的理化性质、磷酸化位点和T、B细胞表位等进行预测和分析。结果:成功构建pET28a-PPE59重组载体,经诱导表达和纯化,成功获得PPE59蛋白;生物信息学预测发现,PPE59有2个开放阅读框,31个磷酸化位点,并含有多个T细胞和B细胞抗原表位。结论:成功构建pET28a-PPE59表达载体,获得高纯度PPE59蛋白,且被抗His-tag小鼠单抗特异性识别;PPE59具有大量的磷酸化位点及丰富的T、B细胞表位,可作为结核病疫苗的重要候选蛋白之一。

结核分枝杆菌PPE15蛋白的原核表达、鉴定及其兔多克隆抗体的制备

目的 克隆、表达和纯化结核分枝杆菌脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸15(PPE15)蛋白,制备并鉴定PPE15蛋白兔多克隆抗体。方法 通过PCR从结核分枝杆菌H37Rv株基因组扩增PPE15基因,利用同源重组克隆技术构建原核表达组氨酸标签PPE15蛋白的pET28a-PPE15载体。将pET28a-PPE15转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导PPE15蛋白表达,通过SDS-PAGE鉴定PPE15蛋白表达。用亲和层析法Ni-NTA柱纯化PPE15蛋白,用复性纯化后的PPE15蛋白免疫新西兰大白兔,制备和纯化多克隆抗体。Western blot法鉴定PPE15蛋白与人血清和多克隆抗体结合特异性,间接ELISA检测多克隆抗体效价。结果 成功构建pET28a-PPE15重组表达载体,PPE15蛋白主要以包涵体形式存在,纯化后在相对分子质量(M;)38 000位置处有单一条带。纯化后PPE15蛋白与结核病患者和多克隆抗体发生特异性反应,多克隆抗体效价达1∶1 300 480以上。结论 成功表达和纯化重组PPE15蛋白,并制备出高效价兔源性多克隆抗体,为进一步研究PPE15蛋白的功能提供了实验基础。

表达绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌感染THP-1巨噬细胞模型的建立

目的建立表达绿色荧光蛋白(GFP)的耻垢分枝杆菌感染THP-1巨噬细胞模型,对耻垢分枝杆菌进行快速定位和直观检测,为探究结核发病机制以及研制新型结核疫苗提供一种示踪工具。方法以pEGFP-N1质粒为模板采用PCR扩增出增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列,获得EGFP的编码基因,将扩增产物克隆到载体pALACE上,建立重组质粒pALACE-EGFP。利用电穿孔技术将pALACE-EGFP转化到耻垢分枝杆菌中,通过潮霉素抗性筛选重组耻垢分枝杆菌克隆,扩大培养后涂片观察,并进行荧光显微镜镜检。再用重组耻垢分枝杆菌感染THP-1巨噬细胞,观察是否有GFP表达。结果正确构建重组质粒pALACE-EGFP;荧光显微镜下观察重组耻垢分枝杆菌,证实EGFP在重组耻垢分枝杆菌中表达,并且THP-1巨噬细胞被感染后发出绿色荧光。结论表达EGFP蛋白的重组耻垢分枝杆菌的成功建立,为结核分枝杆菌的感染和致病机制研究奠定基础。

结核分枝杆菌H37Rv株PE_PGRS35蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析

目的克隆结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)PE_PGRS35基因,构建pET28a-PE_PGRS35重组表达载体,异源表达并纯化MTB H37Rv的PE_PGRS35蛋白,经生物信息学分析后,探讨抗MTB新型靶点。方法PCR扩增PE_PGRS35编码基因,利用重组克隆技术,构建表达载体pET28a-PE_PGRS35,测序鉴定成功后转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中,加入异丙基-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。用Ni柱亲和层析纯化PE_PGRS35蛋白,并对其进行生物信息学分析。结果经测序证明pET28a-PE_PGRS35表达载体构建正确,表达的PE_PGRS35蛋白相对分子质量约53000,主要以包涵体形式存在,纯度达90%。生物信息学分析表明,PE_PGRS35蛋白为酸性不稳定性蛋白,主要二级结构为β-折叠和无规则卷曲,无跨膜区,推测为膜外蛋白,有39个磷酸化位点和2个保守结构域,有Rv1769、PPE8、PPE64、PPE54、PPE24、PPE16、PPE35、PPE6、PPE28、PE2共10个蛋白与PE_PGRS35蛋白相互作用。结论成功获得高纯度的PE_PGRS35蛋白,为进一步开发抗MTB药物新型靶点提供了参考。

结核分枝杆菌Rv0354c基因的克隆及生物信息学分析

从NCBI中获得PPE7蛋白的编码基因序列,设计引物从H37Rv基因组中克隆出Rv0354c基因,将其转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,扩大培养后测序鉴定。同时,运用ORF Finder、BLAST、Protparam、ProtScaleon Expasy、TMHMM Server v.2.0、SignalP4.1 Server、NetPhos3.1 Server、NetAcet1.0 Server、NetNGlyc1.0 Server、SOPMA、SWISS-MODEL、ABCpred、STRING等生物信息学分析工具对PPE7蛋白可能的相关生物学信息进行预测。结果显示,Rv0354c基因成功扩增,测序正确。基因全长426 bp,有2个开放阅读框,其编码蛋白为PPE7,由141个氨基酸组成,等电点为5.45,为疏水性蛋白,跨膜氨基酸数为0.59727,无信号肽、乙酰化位点和N-糖基化位点,有14个磷酸化位点;并且PPE7具有潜在的T、B细胞表位,与多种蛋白质存在相互作用关系,可能为抗结核疫苗的研发提供重要参考。

结核分枝杆菌hemZ蛋白的生物信息学分析

目的应用生物信息学软件预测结核分枝杆菌hemZ蛋白的结构和功能。方法从NCBI中获得hemZ蛋白编码的基因序列,运用生物信息学软件ORF Finder、MEGA、BLAST、Protparam、ProtScaleon Expasy、TMHMM Server v.2.0、SignalP4.1 Server、NetPhos3.1 Server、NetAcet1.0 Server、NetNGlyc1.0 Server、SOPMA、SWISS-MODEL、ABCpred、STRING、MEGA等工具对Rv1485基因编码蛋白hemZ的结构和功能等相关的生物学信息进行预测。结果hemZ蛋白由Rv1485基因编码,该基因全长1035 bp,有8个开放阅读框,由344个氨基酸组成,等电点为5.69,跨膜氨基酸数为0.07436,无信号肽、乙酰化位点和N-糖基化位点,有23个磷酸化位点;蛋白二级结构中α-螺旋占43.31%,β-折叠占11.63%,β-转角占2.33%,无规则卷曲占42.73%;有10个B细胞抗原表位和14个T细胞抗原表位;hemZ蛋白存在于致病性分枝杆菌中,且在其他分枝杆菌中存在相似序列。结论预测结核分枝杆菌hemZ蛋白具有磷酸化位点及良好的T、B细胞表位,且有多个互作蛋白,可作为结核病多肽疫苗的重要候选蛋白。