miR-125b-5p对骨质疏松症大鼠骨丢失的影响及其分子机制

目的探讨微小RNA(miR)-125b-5p对骨质疏松症(OP)大鼠骨丢失的影响及其分子机制。方法从公共基因表达数据库(GEO)获取OP相关数据集筛选差异基因,分析OP患者与健康人miR-125b-5p表达量的差异;通过切除大鼠双侧卵巢构建OP大鼠模型;6只健康清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠均分为OP组(切除大鼠双侧卵巢)和假手术组(只行背部切口,不切除卵巢;Sham组),术后3个月采用显微计算机断层扫描(micro-CT)评价OP模型构建是否成功;另取9只雌性SD大鼠切除双侧卵巢,随机均分为空载体组(agomiR-NC组,agomiR-NC干粉33μg+PBS溶液125μL)、磷酸缓冲溶液(PBS)组(PBS溶液125μL)及miR-125b-5p模拟剂(agomiR-125b-5b组,agomiR-125b-5p干粉33μg+PBS溶液125μL),尾静脉注射,1次/周、持续2个月,干预结束后采用micro-CT扫描各组大鼠胫骨,收集骨体积分数(BV/TV)、骨密度(BMD)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)及结构模式指数(SMI)等骨参数;采用生物信息学技术对miR-125b-5p进行靶基因预测、基因本体(GO)功能和京都基因和基因基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析。结果与健康人群比较,OP患者血浆中有差异miRNA 956个,其中上调502个、下调454个,尤以miR-125b-5p表达升高明显;OP组大鼠胫骨BV/TV及BMD低于Sham组(P<0.05或P<0.01),提示骨质疏松模型造模成功;与agomiR-NC组比较,agomiR-125b-5p组大鼠胫骨BV/TV、Tb.N降低,Tb.Sp、SMI升高(P<0.05),但PBS组与agomiR-NC组大鼠胫骨上述骨参数比较、差异无统计学意义(P>0.05);4种软件及5种软件预测显示miR-125b-5p的靶基因分别为102个、8个,生物过程(BP)主要为pre-microrna的处理、负调控冷诱导产热及调节细胞生长的程度等,分子功能(MF)主要为金属胺肽酶活性、泛素结合酶活性等,KEGG信号通路主要为肾素-血管紧张素系统和泛素介导的蛋白质水解等。结论miR-125b-5p过表达可促进OP大鼠的骨丢失,其机制可能与调节BCL2拮抗剂/杀伤因子1(BAK1)等相关靶基因的表达及肾素-血管紧张素和泛素介导的蛋白质水解信号通路有关。

坏死性凋亡与骨质疏松症机制研究

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种与增龄相关的全身代谢性骨骼疾病,典型特征为骨量减少伴骨组织微结构破坏,使骨的脆性增加、易发生骨折等危险,对患者的生活质量产生严重的影响。坏死性凋亡(necroptosis)是一种非半胱天冬酶(caspase)依赖性的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)形式,具有与坏死相似的形态学特征,其发生机制与受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)、受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)及下游的混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)的级联激活密切相关。随着对OP发病机制探索的不断深入,已有研究证实坏死性凋亡可通过影响成骨细胞、破骨细胞和骨细胞的活性和功能等生物学过程,参与多种原因导致的OP的发生和发展。本文着重阐述坏死性凋亡在OP中的研究进展,旨在为防治OP提供新的见解。

BMSCs分泌的miR-125b通过外泌体途径对体外成骨分化的影响

目的研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的miR-125b是否通过外泌体途径抑制其体外成骨分化。方法提取BMSCs原代,通过流式细胞仪进行其表面抗原(CD45、CD90)的鉴定来确定纯度,分别进行成骨诱导,茜素红染色检测成骨效果;成脂诱导,油红染色检测成脂效果。检测P3代上清液外泌体标志性蛋白CD9、CD63的表达量,电镜下观察确定外泌体提取成功。成骨诱导后的第0、7、14、21天进行qRT-PCR测定外泌体内miR-125b及细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runx2的mRNA的表达量。BMSCs侵染miR-125b模拟物及模拟物阴性对照剂,miR-125b抑制剂及其抑制物阴性对照剂,转染后验证转染效率。转染后五组(前四组+生理盐水空白对照组)细胞上清液外泌体提取,提取后与BMSCs共培养,继续成骨诱导48 h,qPCR及蛋白质免疫印迹(Western Blot)分别测定BMSCs细胞ALP、Runx2、miR-125b的表达量。结果(1)成功分离的BMSCs向成脂、成骨分化。(2)成骨诱导分化期间,P3代BMSCs的成骨标志基因ALP mRNA表达量明显增加,Runx2基因的表达趋势与其相同,而在上清液所提取的外泌体中,miR-125b趋势相反,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)转染后共培养组中模拟物组较模拟物阴性对照组其成骨标志基因ALP、Runx2 mRNA和ALP蛋白表达显著下降,而抑制组较抑制剂阴性对照组其成骨基因ALP、Runx2 mRNA和ALP蛋白表达显著上升,差异有统计学意义(P<0.05)。结论BMSCs来源miR-125b能通过外泌体途径抑制其体外成骨分化。