兔出血症病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立兔出血症病毒(RHDV)的血清学检测方法,本实验通过生物信息学分析,将RHDV衣壳蛋白VP60的3个区域VP60-1(aa2-aa208)、VP60-2(aa174-aa425)和VP60-3(aa342-aa579)分别进行原核表达,获得了大小为42 ku、47.5 ku和45.6 ku的重组蛋白。经ELISA和western blot试验分析显示3种重组蛋白均能够被RHDV阳性血清识别,但VP60-1较VP60-2和VP60-3具有更好的反应原性,因此以表达的重组蛋白VP60-1作为包被抗原建立了RHDV间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性,对不同免疫期兔血清的检测结果与HI呈显著相关性。对临床样品的检测结果表明该ELISA方法比HI试验更敏感。本研究以VP60-1为包被抗原建立的ELISA方法可以用于RHDV疫苗的免疫评估。

1型鸭甲肝病毒和鸭坦布苏病毒液相芯片抗体检测方法的建立

为建立1型鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virustype l，DHAV-1）和鸭坦布苏病毒（duck Tembusuvirus，DTMUV）抗体的液相芯片检测方法，应用RT-PCR从鸭尿囊液中扩增获得714bp的DHAV-1VPl序列和l503bp的DTMUVE序列，将其分别克隆至原核表达载体pCold Ⅲ和pET-28a（＋）并进行表达。通过SDS-PAGE验证DHAV1-VPl和DTMUVE蛋白能够有效表达，通过Westernblot进一步验证表达的蛋白均可与其对应的阳性血清发生反应。根据xMAP液相芯片技术原理，以表达的重组蛋白为抗原分别与不同编号的微球偶联，获得偶联复合体作为捕获载体，建立DHAV-1和DTMUV抗体单一和双重液相蛋白芯片检测方法。结果表明，DHAV-1和DT-MUV的临界值分别为190．30和223．29，灵敏性检测2种阳性血清的抗体水平分别为1：51200和1：6400，重复性验证批内和批间变异系数分别为1．44％和3．94％，为DHAV-1和DTMUV抗体监测提供了高通量、重复性好、特异性高的抗体检测体系。