苦瓜籽蛋白的分离纯化及免疫原性分析

经过NaCl溶液匀浆抽提、硫酸铵分级分离、SP-SepharoseFastFlow层析、SephacrylS-100层析、Macro-Cap-SP层析,从苦瓜籽中同时分离纯化出大量的α-苦瓜素和苦瓜抗HIV蛋白30。经SDS-PAGE鉴定,二者均为单一条带,表观分子量为28kDa。用两种蛋白分别免疫Balb/c小鼠,双向免疫扩散表明,两种苦瓜籽蛋白无交叉反应。本实验为进一步探索PEG修饰MAP30免疫原性变化打下了基础。

抗α-苦瓜素单克隆抗体的制备与鉴定

用α-苦瓜素(α-MMC)免疫小鼠(BALB/c),分离免疫脾细胞,采用聚乙二醇(PEG)法将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选出分泌抗α-MMC素的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株;采用小鼠体内诱生法制备腹水,Mabselect亲和层析纯化McAb,所得McAb经亚类鉴定为IgG2b亚类,通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测,所得McAb与α-MMC特异反应,与相同来源的MAP30无交叉反应,为深入研究α-MMC的结构与功能提供了检测手段。

皱褶假丝酵母脂蛋白脂酶的分离纯化及酶学性质的研究

目的从皱褶假丝酵母的发酵液中纯化脂蛋白脂酶,并对其酶学性质进行研究。方法利用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow和Phenyl Sepharose CL-4B层析等方法进行纯化,利用SDS-PAGE、PAGE和HPLC法进行鉴定。结果获得的脂蛋白脂酶为单一组分,相对分子质量为34 kDa;此酶在50℃、pH6～9时保持稳定;在最适条件下测得其米氏常数(Km)为3.4×10-4mol·L-1;用等电点沉淀法测得脂蛋白脂酶的pI=5.5;Hg+、Cu2+、Ag+和SDS是脂蛋白脂酶的抑制剂,Mg2+和Triton X-100对此酶有激活作用。结论文中方法获得了皱褶假丝酵母脂蛋白脂酶的酶学性质,对此酶在食品、医药和生物技术等领域的应用提供了理论支持。

α-苦瓜素和PEG-α-苦瓜素抑制绒癌JAR细胞迁移和侵袭的研究

目的考察α-苦瓜素(α-MMC)对绒癌JAR细胞体外迁移侵袭行为的影响及其聚乙二醇(PEG)修饰物保留这一活性的程度。方法利用分子量为20 kDa的聚乙二醇氨基酸衍生物[(mPEG)2-Lys-NHS]以共价连接的方式对α-MMC分子表面进行修饰。采用MTT法、细胞黏附试验、划痕损伤试验、transwell法和明胶酶谱法分别检测JAR细胞经α-MMC或PEG-α-MMC作用后细胞的生长、存活、黏附、迁移、侵袭行为及分泌基质金属蛋白酶(MMPs)能力的变化。结果α-MMC及PEG-α-MMC依赖于剂量和时间方式显著抑制了绒癌JAR细胞的生长,PEG-α-MMC可保留67%天然α-MMC的抗增殖活性(1.5 mg.mL-1作用72 h)。经修饰后蛋白处理,细胞分泌的基质金属蛋白酶-2(MMPs-2)活性减弱,削弱了细胞的运动能力,JAR细胞的行进过程受到抑制。结论α-MMC及其PEG修饰物通过减弱MMPs-2活性抑制绒癌细胞的体外行进过程,首次揭示了核糖体失活蛋白可能影响体外肿瘤转移过程。