厌氧表达乳酸脱氢酶以提高大肠杆菌产D-乳酸光学纯度

【目的】为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题。【方法】构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5和HBUT-D7。通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵。【结果】HBUT-D7的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株。以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率分别为10.41 mg/(L·h)及34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为4.24 g/(L·h)及3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.07%及99.92%。以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为1.93 g/(L·h)及1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.22%及99.99%。【结论】厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度。

强化厌氧表达dld基因以提高大肠杆菌工程菌发酵产L-乳酸的光学纯度

为去除廉价发酵原料中的D-乳酸从而提高发酵最终产物L-乳酸的光学纯度,该研究通过构建带有不同厌氧诱导启动子(pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB)的D-乳酸脱氢酶基因(dld)的表达质粒,并将其分别转入大肠杆菌(Escherichia coli)HBUT-L,加强其在发酵产L-乳酸的同时消除外源D-乳酸的能力。通过装液量与转速的单因素试验筛选最优的质粒表达条件及菌株,并在无机盐培养基与玉米浆培养基中进行发酵验证。结果表明,在装液量为200 mL/250 mL、转速为150 r/min的条件下,含有启动子pflBp6-pnirB的表达质粒的工程菌株HBUT-L4发酵18 h时D-乳酸脱氢酶活力最高,为81.1 U/g。在此条件下进行无机盐培养基和玉米浆培养基发酵时,工程菌株HBUT-L4相对于出发菌株HBUT-L,D-乳酸消耗速率分别提高250%、217%,L-乳酸的光学纯度分别从96.32%、98.48%提升至99.95%、99.98%。在大肠杆菌工程菌发酵L-乳酸的过程中,带有厌氧诱导启动子pflBp6-pnirB的表达质粒可提高D-乳酸脱氢酶活力,强化菌株消除外源D-乳酸,进而提高L-乳酸的光学纯度的能力,具有重要的工业化应用价值。

大肠杆菌L-乳酸工程菌消除外源D-乳酸以提高光学纯度的研究

L-乳酸的同分异构体D-乳酸会引起代谢性酸中毒、肠道屏障受损或其他未知的危害,因此需要减少用作食品酸味剂的L-乳酸中的D-乳酸含量。该研究通过加入硝酸钠以加强大肠杆菌L-乳酸工程菌在厌氧条件下对外源D-乳酸的消除;同时敲除L-乳酸脱氢酶基因(lldD基因、ykgEFG基因)以降低其对L-乳酸的消耗。摇瓶发酵实验证明,敲除L-乳酸脱氢酶基因的工程菌HBUT-LB,在添加20 mmol/L硝酸钠后,可有效清除1 g/L的外源性D-乳酸。在7 L发酵罐中利用含有D-乳酸的廉价原料进行发酵,添加20 mmol/L硝酸钠相对于未添加硝酸钠,工程菌HBUT-LB的D-乳酸消耗速率提高460%,L-乳酸的光学纯度从99.32%提升到99.99%。同时,最终发酵液中无硝酸钠与亚硝酸钠残留。结果表明,大肠杆菌工程菌HBUT-LB在发酵过程中,通过添加硝酸钠,可有效消除外源D-乳酸,提高L-乳酸的光学纯度,具有精制超高光学纯度L-乳酸的工业应用价值。

重组大肠杆菌全细胞转化苹果酸合成丙酮酸

拟建立一条以苹果酸为原料,通过大肠杆菌全细胞转化获得丙酮酸的合成途径。以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,在pET28a上共表达内源的苹果酸酶(ME)和来自博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的醛糖还原酶(AR),并对细胞浓度、底物浓度、温度和pH值等催化关键因素进行研究。共表达后大肠杆菌苹果酸酶和博伊丁假丝酵母醛糖还原酶酶活分别为(2.8±0.21),(3.1±0.34)U/mL。适宜的催化条件为:细胞浓度OD600nm值为30,底物苹果酸质量浓度为30 g/L,木糖和苹果酸物质的量比为1.0,温度为40℃,反应体系pH值为7.8,丙酮酸产量最高可达23.16 g/L。本研究为生物法合成丙酮酸提供了一种新的方法。

基于氢氧化钙为中和剂的大肠杆菌丁二酸发酵

氢氧化钙因其价格相对低廉且与其配套的有机酸分离纯化工艺成熟,常作为中和剂应用于有机酸发酵中。但在丁二酸发酵中,因其不能提供丁二酸合成所必需的二氧化碳,存在发酵产量低的问题。文章建立并优化了以氢氧化钙为中和剂结合二氧化碳脉冲补料发酵生产丁二酸的方法。发酵初期不添加中和剂,pH值自然下降至5.7时,立即流加23%氢氧化钙溶液使pH值升至7.5,然后停止添加中和剂,通入0.2 m^(3)/(m^(3)·min)二氧化碳气体至pH值降至6.5时停止通气使发酵液自然发酵,当pH值下降至5.7时,再循环上述操作。使用该方法时,发酵产量为88.47 g/L,糖酸转化率为96.03%,平均生产强度为2.21 g/(L·h),相较于以氢氧化钙为中和剂不补入或者连续通入二氧化碳的方式,糖酸转化率分别提高了298%和95%。该方法为解决使用氢氧化钙作中和剂发酵丁二酸产量低的问题提供了新思路,也为利用现有有机酸分离设备大规模生产丁二酸打下了良好基础。

球孢白僵菌利用D-PPA合成D-HPPA的发酵条件优化

为了提高球孢白僵菌(Beauveria bassiana)利用R-(+)-2-苯氧基丙酸(D-PPA)合成R-(+)-2-(4-羟基苯氧基)丙酸(D-HPPA)的能力,在单因素试验的基础上,通过Plackett-Burman设计和Box-Behnken中心组合设计优化球孢白僵菌生物合成D-HPPA的液态发酵条件。结果表明,当D-PPA初始添加浓度为40 g/L时,液态发酵最优条件为葡萄糖38.70 g/L、蚕蛹粉15 g/L、FeCl_(2)1.0 g/L、接种量15%(V/V)、pH 6.6及发酵温度28℃时,D-HPPA的产量为(25.10±0.43)g/L,D-HPPA的产率为57.24%±0.97%,比优化前提高了159%。

pH值对水稻秸秆厌氧发酵产沼气的影响

[目的]研究pH值对水稻秸秆厌氧发酵产沼气的影响,为促进秸秆发酵产沼气提供试验参数和理论依据。[方法]从产物生成、催化剂活性和原料利用3个方面评价不同发酵起始pH值对沼气产生的影响。[结果]在发酵液起始pH值为7.0时,稻草秸秆发酵产沼气的量最高,发酵液TS、VS降低程度最大,分别为29.2%和24.6%,且产气过程中辅酶含量也最大。[结论]控制发酵体系的pH值(7.0～7.2),使产甲烷菌处于最佳的生存状态,是提高水稻秸秆发酵产沼气的关键。

离子液体中脂肪酶催化拆分外消旋烯丙酮醇反应

以离子液体为溶剂,考察了溶剂类型、水活度、温度、pH值和共溶剂等因素对脂肪酶催化拆分外消旋烯丙酮醇(R,S)-4-羟基-3-甲基-2-(2-丙烯基)-2-环戊烯-1-酮反应的影响,并与常用于外消旋烯丙酮醇拆分的有机溶剂乙酸乙烯酯进行了比较.结果表明,在离子液体[bmim]PF6中脂肪酶的催化性能较好,酶初始反应速率为18.48μmol/(g.min),半衰期为74.53h,高于在乙酸乙烯酯中的相应值(9.18μmol/(g.min)和64.29h).但离子液体中拆分反应的转化率低于在乙酸乙烯酯中的转化率,可以通过向离子液体中补加酰基供体来提高外消旋烯丙酮醇的转化率.两种反应介质中最佳酶反应条件均为水活度0.17,温度40℃和pH=7,但加入共溶剂后,离子液体中脂肪酶催化拆分外消旋烯丙酮醇的效率降低,而在乙酸乙烯酯中则有所提高.

离子液体中脂肪酶催化合成乙酸香叶酯的研究

对脂肪酶在离子液体中催化香叶醇与乙酸乙烯酯转酯化反应生成乙酸香叶酯的过程进行了研究.考察了水活度、底物酯和醇物质量的比率、温度、离子液体和酶的重复利用对催化得率及催化反应初始速率的影响,其中离子液体的水活度采用水合盐对进行控制,而在考察离子液体和酶的重复利用时采用了未经分离酶的间歇反应的方法.结果表明,随着水活度增加酶在离子液体1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸盐中催化反应的初始速率的变化趋势呈钟形曲线.最优的催化反应条件为:水活度为0.28,底物酯和醇物质量比为9.42,30℃.在重复利用12次后,离子液体体积和酶的催化活力都没有明显减少.

金属离子及表面活性剂对秸秆发酵产沼气的影响

通过测定产气量、发酵后料液的pH值及辅酶F420的浓度、TS和VS的降解率来评价金属离子及表面活性剂对秸秆发酵产沼气的影响。结果表明,添加100μmol/LMg2+或Co2+对产沼气有促进作用,添加0.125%(质量分数,下同)的吐温80有助于产气量的进一步提高,但加入1.25%的吐温80时,沼气产量反而降低。组合添加100μmol/LMg2+和0.125%的吐温80后,发酵液的pH值更接近中性。添加100μmol/LMg2+或Co2+对发酵液中辅酶F420的浓度影响不大。

水稻秸秆厌氧发酵产沼气工艺的响应面法优化

在单因素实验的基础上,采用Box-Benhnken设计,选取接种物与原料质量比、发酵起始pH值和活性炭添加量为工艺考察参数,对水稻秸秆发酵产沼气工艺进行了响应面法优化。确定水稻秸秆厌氧发酵产沼气的最佳工艺条件为:接种物与原料质量比1.28∶1、起始pH值7.35、活性炭添加量11.48 g.L-1,此条件下每50 g水稻秸秆的沼气平均产气量为5833.2 mL,与优化前相比提高了34.4%。

面包酵母不对称还原酮基泛解酸内酯

目的：利用市售面包酵母作催化剂,对酮基泛解酸内酯不对称还原进行了研究,并考察了底物浓度、辅因子、环糊精添加量和pH值对不对称还原反应的影响。方法：以市售面包酵母作催化剂,酮基泛解酸内酯作为底物在摇瓶中进行催化,用手性色谱柱对催化产物进行了检测。结果：发现反应条件为底物浓度低于2.56mg/ml,辅因子选用蔗糖,β-环糊精添加量为16.7mg/ml,pH 4-5适合于酮基泛解酸内酯的不对称还原。在如上优化的催化条件下,产物得率大于45%,对映体过量率（e.e.）大于90%。结论：以酵母细胞作催化剂进行酮基泛解酸内酯不对称还原工艺具有生产光学纯泛解酸内酯的潜力。

以应用为导向的酶工程教学改革探讨

提出"以应用为导向"的教学方式,从理论讲述、作业训练、试验教学和考试考核方面倡导学生"以应用为导向"进行酶工程的课程学习。该教学方式包括:理论讲述中穿插应用范例提升学生学习积极性及学习兴趣;以文献阅读和文献分析为课后训练主体提升学生应用知识能力;以自主设计型实验引导学生更积极应用知识;以设计型考题进行知识考察促进学生综合应用知识的能力。实践结果表明,该教学方式在一定程度上切实有效提高了学生解决酶应用方面相关问题的能力,取得了良好的教学效果。

树脂对沼气发酵的影响

选用比表面积基本一致而表面电荷不同的树脂作为吸附剂,研究了树脂对沼气发酵的影响。研究结果表明,不同吸附剂对沼气产气量影响排序为强酸性树脂>强碱性树脂>活性炭>弱酸性树脂>吸附树脂>空白>弱碱性树脂。添加吸附剂对厌氧发酵后发酵液的pH值没有明显影响,可初步排除添加树脂是通过解除产物抑制或改变发酵液pH值来影响沼气发酵的可能。

一种产邻苯二酚菌株高通量筛选方法

目的:对产邻苯二酚菌株进行筛选。方法:采用前期筛得的产邻苯二酚菌为出发菌株,通过硫酸二乙酯诱变的方法使该菌株突变,同时建立96孔板培养和酶标仪检测方法对产邻苯二酚菌株进行高通量筛选。结果:硫酸二乙酯的终浓度为0.1%,诱变时间为8 min的条件下,突变菌致死率为84.5%,突变效果最好。筛选培养基中吸光值(495nm)和富集培养基中菌液浊度值(OD630)的加和值较大的突变菌株产邻苯二酚能力高。通过诱变和筛选得到的菌株,产邻苯二酚浓度可达0.87mg/ml,比出发菌株的提高了262.5%。经过形态学和生理生化反应,初步鉴定该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。结论:硫酸二乙酯诱变和96孔板筛选的方法能以高通量方式快速筛选出产邻苯二酚菌株。

不同吸附剂对棉花秸秆沼气发酵效率的影响研究

用6%的NaOH处理1周的棉花秸秆粉末为原料,以活性污泥为接种物,添加颗粒活性炭、聚乙烯醇、硅胶、高岭土等活性吸附剂,以辅酶F420浓度、pH值变化、产气量检验吸附剂优良性。结果表明:添加颗粒活性炭的试验组与其他各组相比,辅酶F420浓度明显上升,总产气量提高了94.5%,说明颗粒活性炭是一种良好的提高沼气发酵效率的吸附剂。

棉花秸秆厌氧发酵产沼气工艺条件的研究

以棉花秸秆为原料,在严格控制厌氧发酵温度的条件下(37±1℃),研究不同接种物在不同接种量下的发酵产气效果。结果发现:以污泥或猪粪作接种物,60g/L的接种量效果较好,累积产气量分别为10.252L、10.518L,COD的去除率分别为53.1%、48.5%;混合物做接种物时,接种量以45g/L产气较好,累积产气量为14.228L,COD的去除率为55.9%。接种量相同时,混合接种物的产气效果最好,累积产气量比单一接种物猪粪和鱼塘污泥高7.3%～98.4%,平均日产气量高3.1%～67.3%,表明适量的猪粪和鱼塘污泥组成的混合接种物在棉花秸秆厌氧发酵产气中起着重要作用。

基于生化课程群建设的酶工程实验教学探讨

以生物化学课程为龙头,现代生化技术、生化工程及酶工程为主体的工科生物化学课程群,并在此基础上,实现实验内容安排上进行有定位的教学,实验技能培养方面进行有导向的教学,实践认知上进行有过渡的教学模式。酶工程教学方式。

不同秸秆厌氧发酵产沼气效果的比较

以猪粪为接种物,以水稻秸秆、玉米秸秆和棉花秸秆为发酵原料,在严格控制发酵温度(37±1)℃的条件下进行厌氧发酵产沼气的研究。研究结果表明,3种秸秆的日产气量在第1天达到峰值后都出现明显的回落,在第6～7天开始逐渐上升并形成第2个产气高峰,之后逐渐下降。棉花秸秆的平均日产气量、累积产气量和甲烷含量(体积分数,下同)最高(分别为114 ml,3 663 ml和58.2%),玉米秸秆次之(分别为111 ml,3 121 ml和54.6%),水稻秸秆最低(分别为91 ml,2 457ml和50.2%)。添加氨水的各试验组的指标高于不添加氨水的各对照组的指标。

拟康氏木霉和白腐菌混菌发酵处理稻草秸秆的研究

以拟康氏木霉3.3002(Trichoderma pseudokoningii)和白腐菌5.776(Phanerochaete chrysosporium)的混合菌发酵处理稻草秸秆,并对处理结果进行了试验研究。研究结果表明,当接入拟康氏木霉与白腐菌时间间隔为3d,接种液体积比为2ml∶2ml,氮源为0.3%(质量分数)的(NH4)2SO4,发酵时间为8d时,稻草秸秆纤维素降解率和木质素降解率分别为40.38%和31.52%,比单独使用拟康氏木霉(纤维素和木质素降解率分别为24.62%,13.78%)或白腐菌(纤维素和木质素降解率分别为6.96%,20.06%)处理稻草秸秆的效果有显著提高。