基于N-ELISA的呼吸道合胞病毒快速中和抗体检测方法的建立

目的制备针对呼吸道合胞病毒(RSV)N蛋白的兔多克隆抗体,以其作为检测抗体建立基于ELISA的快速中和抗体检测方法。方法构建pET30a-N质粒,表达纯化N蛋白,免疫新西兰兔制备针对RSV N蛋白的多克隆抗体作为检测抗体。阳性血清系列稀释后与100半数组织培养感染剂量(TCID 50)/孔的RSV中和,接种Hep-2细胞培养,80%丙酮固定细胞,ELISA方法检测感染细胞中病毒的N蛋白,当每孔的吸光度值低于临界值时,视为中和试验阳性孔,阳性孔血清的最高稀释度为该血清的中和抗体滴度。优化抗体稀释度、检测时间、细胞密度及中和时间,建立基于N-ELISA的中和抗体检测方法,对建立的实验方法进行细胞代次、边缘孔效应、准确性、重复性以及精密度验证,初步应用于人RSV IgG阳性血清检测,分析与微量中和法的相关性。结果成功构建出pET30a-N质粒,表达纯化的N蛋白纯度较高,特异性良好;三免后兔血清效价为1∶51200,可特异性结合RSV;制备的抗RSV N兔多抗的效价为1∶51200,特异性良好,建立的快速中和抗体检测方法在4 d就可检测,中和时间可缩短至30 min,细胞代次、96孔板位置(边缘孔和非边缘孔)对该方法检测无影响,重复性、精密性、准确度良好,建立的方法和微量中和法检测64份RSV IgG阳性人血清,相关系数为0.9296,证明两种方法具有良好的正相关性。结论成功建立基于ELISA的快速中和抗体检测方法,可用于评价RSV疫苗接种后的血清抗体水平。