一起由产毒素多杀性巴氏杆菌引起的母猪流产

对吉林省某规模化养猪场暴发的一种临床上以流产为特征的疫病进行了研究。结果从流产胎盘和流产胎儿的实质器官和心血中分离出一种革兰阴性的小杆菌,分离菌株的形态学、培养特性、生化特性和分子生物学特性的鉴定结果显示,所分离的菌株为多杀性巴氏杆菌,命名为Pm-CC21。序列测定与分析结果表明,Pm-CC21为荚膜多糖基因型D型。药敏试验结果显示分离菌株对大多数药物敏感,尤其对头孢氨苄和环丙沙星极为敏感。根据药敏试验结果对猪群进行给药治疗,同时结合猪场情况采取其他综合性措施,有效控制猪场疫情。应用PCR方法从胎盘与胎儿组织中未检测出猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和布鲁菌。本研究报道了一起少见由多杀性巴氏杆菌引起的母猪流产和早产的疫病,应引起国内同行的重视。

宿主通过激活NLRP3信号通路抑制HY12肠道病毒的复制

采用Q-PCR、Western blot和ELISA的方法检测巨噬细胞感染HY12病毒后NLRP3、IL-1β和Caspase-1等蛋白的表达水平及细胞上清中IL-1β的表达量,以确定巨噬细胞感染病毒后NLRP3通路的变化情况。同时应用IL-1β预处理小鼠原代巨噬细胞与NLRP3敲除小鼠原代巨噬细胞系,检测HY12病毒感染后细胞中病毒结构蛋白的表达水平,探究了NLRP3通路激活刺激IL-1β分泌对病毒复制的影响,并以小鼠模型进行了验证。结果显示,巨噬细胞感染HY12病毒后激活了NLRP3炎性小体信号通路,上调NLRP3、IL-1β和Caspase-1等蛋白的表达,且表达水平呈现病毒剂量与时间依赖性。同时发现IL-1β预处理的巨噬细胞感染HY12病毒后,病毒结构蛋白表达显著下降;而NLRP3敲除的小鼠巨噬细胞感染HY12病毒后,相比正常巨噬细胞感染病毒后病毒的结构蛋白表达更高。此外,与野生型小鼠感染HY12病毒相比,NLRP3敲除小鼠感染后病毒的复制明显增强。结果表明,宿主在HY12病毒感染后通过激活NLRP3信号通路及刺激IL-1β的分泌,进而抑制病毒的复制。

双抗体夹心ELISA检测羊肠道病毒抗原方法的建立及病原流行病学调查

应用本实验室分离的国内首株羊肠道病毒(CEV)-JL14VP1重组蛋白制备的兔源多克隆抗体和抗CEV-JL14病毒的单克隆抗体,建立了检测CEV抗原的双抗体夹心ELISA方法,并对吉林省和内蒙古地区羊群感染CEV进行了病原流行病学调查。方阵试验确定了CEV VP1鼠源IgG捕获抗体的最佳包被量为0.2μg/孔,酶标抗体的最佳稀释倍数为1∶1 000。对大量CEV阴性粪便样品进行检测与统计学处理,确定了双抗体夹心ELISA检测CEV的判定标准为样品D490值≥0.216判定为阳性。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,所建立的检测CEV抗原方法具有特异、敏感、快速和重复性好等特点。以建立的双抗体夹心ELISA方法,对吉林省和内蒙古不同地区的羊群粪便样品进行了检测,发现不同地区的羊群都存在着严重的CEV感染,感染率高达12%~100%。本研究为今后CEV感染的诊断、检疫及防制提供了有效的手段和流行病学理论依据。

检测F种肠道病毒双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

依据F种肠道病毒(enterovirus species F,EV-F)SD-S67毒株的基因组序列设计合成引物,RT-PCR扩增出该毒株的VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1的BamHⅠ/EcoRⅠ位点,表达出VP1重组蛋白。以纯化VP1重组蛋白为免疫原,制备兔源多克隆抗体,并以制备的抗体建立了检测F种肠道病毒的双抗体夹心ELISA方法,同时对山东和河南省部分地区牛群感染EV-F进行了初步的流行病学调查。结果显示,捕获抗体的最佳包被量为400 ng/孔,HRP酶标抗体的最佳稀释倍数为1∶400;确定的方法判断标准为样品的D_(490)>0.217时判定为阳性。建立的ELISA方法可以特异性检测出EV-F病毒抗原,而EV-E和BVDV病毒抗原检测结果均为阴性,表明方法具有较好的特异性。以建立的ELISA方法检测不同稀释倍数的阳性样品,结果稀释1000倍后的样品检测结果仍为阳性,表明建立的方法具有较高的敏感性。应用建立的方法检测部分样品,组内变异系数为1.05%~9.24%,组间变异系数为1.39%~6.78%,说明该方法具有良好的重复性。同时部分样品的ELISA和PCR方法的检测结果显示,两者的符合率为100%。以该方法对山东、河南两地牛群样品进行检测,结果显示牛群的EV-F的感染率分别为12%和8%。结果表明,建立的F种肠道病毒双抗体夹心ELISA方法具有较高的特异性、敏感性,且快速简便,可用于F种肠道病毒感染的诊断与流行病学调查。

从吉林省发生先天性关节弯曲-脑积水综合征新生犊牛分离鉴定出阿卡班病毒

本研究针对吉林省多地发生的一种新生犊牛先天性畸形和脑积水,临床上以四肢关节弯曲呈蜷缩状、无法伸直、不久发生死亡为特征的疾病进行了流行病学调查及病原分离与鉴定。结果应用MDBK细胞从发病与病死动物体内分离出3株病毒,命名为JL-AKA-CC21-1株、JL-AKA-CC21-2株和JL-AKA-YJ21。电镜负染观察显示,分离病毒粒子大小为70~130 nm,与病料中观察的病毒粒子相同。病毒接种MDBK细胞可引起典型的细胞病变,病变细胞聚集、变圆与脱落。分子生物学鉴定结果表明,上述分离毒株均为阿卡班病毒(Akabane virus, AKAV)。本研究从发生新生犊牛先天性畸形和脑积水的病死牛体内分离出AKAV,该研究结果将对今后吉林省本病的防控提供理论依据。

应用酵母双杂交技术筛选E种肠道病毒HY12-VP1蛋白的互作蛋白

为筛选E种肠道病毒HY12毒株编码VP1蛋白的宿主互作蛋白,本试验应用PCR技术扩增出HY12病毒VP1蛋白基因的完整序列,并将其克隆到酵母载体pGBKT7中,构建重组诱饵质粒pGBKT7-VP1。将重组质粒转化到酵母菌株AH109中,通过对比重组质粒组和空白质粒组不同时间点的D600值,检测其对酵母细胞的毒性,并把含有诱饵重组质粒的酵母菌涂布在缺陷型培养基上验证其自激活活性。将转有诱饵载体的AH109菌株与表达MDBK细胞的cDNA文库的Y187菌株混合培养,通过缺陷型培养基筛选杂交成功的菌落,并应用序列测定与比对分析和酵母回返试验等方法进行验证。提取阳性菌落的酵母质粒,通过缺陷型培养基及菌液PCR等方法,筛选到12个潜在HY12病毒VP1的互作蛋白,该结果为研究牛肠道病毒(BEV)感染机制及病毒结构蛋白VP1的功能等打下基础。

吉林省牛病毒性腹泻病毒与牛肠道病毒混合感染的流行病学调查

应用检测牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)与牛肠道病毒(bovine enterovirus, BEV)抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒,分别对2019-2020年采集于吉林省5个地区的738份粪便样品进行检测,并以PCR和免疫荧光试验对部分样品进行了确证。结果显示,吉林省不同地区、不同年龄及不同品种的牛群均存在BVDV与BEV混合感染,其中,BVDV感染率为10.26%~42.65%,BEV感染率为8.33%~20.83%,2种病毒的混合感染率为3.42%~14.71%。对不同品种牛群BVDV与BEV混合感染的检测结果显示,荷斯坦牛混合感染率为13.04%、西门塔尔牛为7.84%、延边牛为3.65%、利木赞及其他牛群为3.42%。检测不同年龄牛群混合感染的结果显示,各个年龄牛群均存在不同程度的BVDV与BEV混合感染,其中,成年牛群混合感染率高达57.63%,犊牛混合感染率为3.39%。PCR和免疫荧光试验检测结果显示,在BVDV与BEV混合感染的样品中均可同时扩增出或检测出BVDV与BEV的混合感染。本研究首次揭示出吉林省牛群的BVDV与BEV混合感染,丰富了BVDV及BEV感染的流行病学数据,为吉林省乃至国内BVDV与BEV感染的净化及防控提供了流行病学的理论基础。

鉴别牛肠道病毒感染复合PCR方法的建立及初步应用

牛肠道病毒(bovine enterovirus, BEV)感染是国内近年来报道的一种临床上以消化道、呼吸道症状为特点的新发传染病,其病原体为小RNA病毒科肠道病毒属中的成员。目前,BEV分为EV-E和EV-F 2个病毒种,两者间的核苷酸序列差异很大,属于不同的血清型/基因型,常规血清学方法难以将其区别。为建立一种鉴别EV-E和EV-F病毒的方法,本研究根椐GenBank已发表的EV-E和EV-F肠道病毒的基因组序列,设计合成引物,建立了鉴别EV-E和EV-F的复合PCR方法,并确定了该方法的特异性、敏感性和重复性。同时,应用该方法检测吉林省长春地区疑似BEV感染样品。结果显示,建立的方法具有良好的特异性,只能检测出EV-E或EV-F肠道病毒,而牛细小病毒、牛病毒性腹泻病毒等病原检测均为阴性。敏感性试验结果显示,EV-E和EV-F最低检出量分别为3.67×10^(2),5.21×10^(3)拷贝/μL。检测长春地区的32份牛粪便样品的结果显示,EV-E和EV-F病毒的检出阳性率分别为28.13%和34.38%,两种病毒混合感染率为15.63%,与间接ELISA检测方法结果一致。上述结果表明,本试验建立的复合PCR方法具有特异性强,灵敏度高、快速与简便等特点,可用于EV-E和EV-F两种肠道病毒的鉴别诊断及流行病学调查。

检测羊肠道病毒RT-PCR方法的建立及初步应用

羊肠道病毒(caprine enterovirus,CEV)感染为国内外新发疫病,其诊断方法尚缺乏研究。本研究依据CEV-JL14毒株的基因组序列,设计合成了1对特异性引物,建立了检测CEV的RT-PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行测定,同时应用该方法对疑似CEV感染的临床样品进行检测。结果显示,建立的检测CEV感染的RT-PCR方法具有特异性好、敏感性高、快速和简便等特点,最低检出限为1.13×10^(3)copies/μL。以建立的RT-PCR方法对通过ELISA方法确定的6份阳性样品和22份阴性样品进行检测,结果显示两者的符合率为100%。本研究建立的RT-PCR方法可用于CEV感染的诊断和流行病学调查。

新疆地区牛肠道病毒的病毒分离鉴定及毒株差异

牛肠道病毒感染是由牛肠道病毒(bovine enterovirus,BEV)引起的一种临床上以呼吸系统、消化系统和神经系统症状为主要特征的传染病。作为国内新发传染病,该病在新疆地区牛群的感染情况缺乏研究。本研究应用双抗体夹心ELISA方法对采集于新疆不同区域牛群的740份牛粪样品进行BEV抗原检测,并进行了病毒的分离鉴定及遗传进化分析。结果显示,新疆不同地区牛群均存在程度不同的BEV感染,感染率为7.8%~24.3%。应用Vero细胞从部分阳性样品中分离获得了3株病毒,理化学特性、生物学特性及免疫学特性鉴定结果显示,分离的3株病毒均为肠道病毒,命名为BEV-XJY48、BEV-XJZ97和BEV-XJS128。分离毒株的5′UTR基因序列测定与遗传进化分析显示,3株BEV毒株均为E种肠道病毒。本研究结果揭示出新疆不同地区牛群存在BEV感染,丰富了国内BEV感染的流行病学资料,为今后新疆地区该病的防控提供了理论依据。

E种肠道病毒HY12毒株非结构蛋白3C单克隆抗体的制备与鉴定

为了研究国内分离的首株E种肠道病毒HY12毒株的非结构蛋白3C的功能,本研究以设计合成非结构蛋白3C的特异性引物,PCR扩增出3C的基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒。将构建的阳性质粒转化到大肠杆菌菌株BL21中,以IPTG诱导表达3C重组蛋白及应用尿素纯化包涵体的方法纯化重组蛋白。以纯化的3C蛋白作为免疫原免疫6周龄健康的BALB/c小鼠,经3次免疫后,采集其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经过筛选和亚克隆等过程获得能够稳定表达3C单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。应用鼠单克隆亚型鉴定试剂盒鉴定出该杂交瘤细胞株所分泌的抗体类型为IgM。以过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和间接ELISA试验鉴定该单克隆抗体的反应原性和特异性,结果表明本试验获得了HY12非结构蛋白3C的单克隆抗体能够特异性检测出牛肠道病毒抗原,为进一步研究E种肠道病毒非结构蛋白3C的功能奠定了基础。