目的:构建人源肝癌天然库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体库,为开发治疗性人源抗体奠定良好的实验基础。方法:分别收集40例人新鲜外周血各2mL(包括健康成年人和肝癌患者),进行淋巴细胞分离和总RNA的提取,通过设计合适的优化引物用...目的:构建人源肝癌天然库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体库,为开发治疗性人源抗体奠定良好的实验基础。方法:分别收集40例人新鲜外周血各2mL(包括健康成年人和肝癌患者),进行淋巴细胞分离和总RNA的提取,通过设计合适的优化引物用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区基因(variable region of heavy chain,VH)、轻链可变区基因(variable region of light chain,VL)和作为间隔区的轻链恒定区基因(consis tregion of light chain,CK)。采用改进的重叠延伸PCR(SOEPCR)技术将VH和VL进行拼接,连接肽为Linker(Gly4Ser)3。之后引入构建核糖体展示单链抗体(scFv)库模板所需元件,包括一个T7启动子、一个核糖体结合位点(Kozak序列)和翻译起始密码,以及作为间隔区的CK基因。模板基因片段连接T-载体转化E.coliDH5a大肠杆菌,对所构建的单链抗体库进行菌落PCR鉴定和测序分析。结果:①构建了库容量为2.65×1013的人源肝癌单链抗体库;②经菌落PCR鉴定和测序分析阳性重组子的序列,我们发现该抗体库具有丰富的多样性。结论:采用改进的重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,对构建库容量高、多样性好的人源性肝癌核糖体展示单链抗体库,提高了建库效率。成功构建的抗体库,为后续筛选抗体、抗体修饰等工作打下扎实的实验基础。展开更多
实蝇类昆虫遍布世界的热带、亚热带和温带地区,多为国内外重点关注的重要农业检疫性害虫。目前,针对实蝇的检疫鉴定多依据成虫的形态特征进行,但对残缺虫体、幼虫、蛹等,则无法进行有效鉴定。DNA条形码技术是一种近些年来发展迅速的物...实蝇类昆虫遍布世界的热带、亚热带和温带地区,多为国内外重点关注的重要农业检疫性害虫。目前,针对实蝇的检疫鉴定多依据成虫的形态特征进行,但对残缺虫体、幼虫、蛹等,则无法进行有效鉴定。DNA条形码技术是一种近些年来发展迅速的物种鉴定分子生物学方法 ,作为传统形态学物种鉴定方法的补充,它利用一个短的DNA片段做标记,以帮助确定某一物种。本研究利用传统形态学方法,结合DNA条形码技术,利用一对通用引物,对具条实蝇Bactrocera scutellata和南瓜实蝇Bactrocera tau 2种实蝇类害虫DNA的COI基因进行扩增,扩增PCR产物经测序后同NCBI及BOLD数据库比对进行物种鉴定。结果表明,传统昆虫形态鉴定方法以DNA条形码技术为辅助,既能对实蝇类昆虫进行准确鉴定。展开更多
探讨微滴数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)技术在猪肉掺假检测中的应用价值。提取猪肉肌肉组织中的基因组DNA,设计猪源性内标基因引物及探针序列,以ddPCR进行扩增读取结果,在不同物种中进行特异性检测,利用标准质粒DNA检测最低下限...探讨微滴数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)技术在猪肉掺假检测中的应用价值。提取猪肉肌肉组织中的基因组DNA,设计猪源性内标基因引物及探针序列,以ddPCR进行扩增读取结果,在不同物种中进行特异性检测,利用标准质粒DNA检测最低下限拷贝浓度;在不同掺杂量组织中检测最低比例。结果表明,猪源性ddPCR检测体系特异强,在10~2000 copies/μL的范围内具有较高的检测线性,RSD值小于25%,可检测至猪肉掺杂量为1%的混合样品。基于ddPCR的检测猪肉掺假的方法具有较高的实际应用价值。展开更多
文摘目的:构建人源肝癌天然库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体库,为开发治疗性人源抗体奠定良好的实验基础。方法:分别收集40例人新鲜外周血各2mL(包括健康成年人和肝癌患者),进行淋巴细胞分离和总RNA的提取,通过设计合适的优化引物用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区基因(variable region of heavy chain,VH)、轻链可变区基因(variable region of light chain,VL)和作为间隔区的轻链恒定区基因(consis tregion of light chain,CK)。采用改进的重叠延伸PCR(SOEPCR)技术将VH和VL进行拼接,连接肽为Linker(Gly4Ser)3。之后引入构建核糖体展示单链抗体(scFv)库模板所需元件,包括一个T7启动子、一个核糖体结合位点(Kozak序列)和翻译起始密码,以及作为间隔区的CK基因。模板基因片段连接T-载体转化E.coliDH5a大肠杆菌,对所构建的单链抗体库进行菌落PCR鉴定和测序分析。结果:①构建了库容量为2.65×1013的人源肝癌单链抗体库;②经菌落PCR鉴定和测序分析阳性重组子的序列,我们发现该抗体库具有丰富的多样性。结论:采用改进的重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,对构建库容量高、多样性好的人源性肝癌核糖体展示单链抗体库,提高了建库效率。成功构建的抗体库,为后续筛选抗体、抗体修饰等工作打下扎实的实验基础。
文摘实蝇类昆虫遍布世界的热带、亚热带和温带地区,多为国内外重点关注的重要农业检疫性害虫。目前,针对实蝇的检疫鉴定多依据成虫的形态特征进行,但对残缺虫体、幼虫、蛹等,则无法进行有效鉴定。DNA条形码技术是一种近些年来发展迅速的物种鉴定分子生物学方法 ,作为传统形态学物种鉴定方法的补充,它利用一个短的DNA片段做标记,以帮助确定某一物种。本研究利用传统形态学方法,结合DNA条形码技术,利用一对通用引物,对具条实蝇Bactrocera scutellata和南瓜实蝇Bactrocera tau 2种实蝇类害虫DNA的COI基因进行扩增,扩增PCR产物经测序后同NCBI及BOLD数据库比对进行物种鉴定。结果表明,传统昆虫形态鉴定方法以DNA条形码技术为辅助,既能对实蝇类昆虫进行准确鉴定。
文摘探讨微滴数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)技术在猪肉掺假检测中的应用价值。提取猪肉肌肉组织中的基因组DNA,设计猪源性内标基因引物及探针序列,以ddPCR进行扩增读取结果,在不同物种中进行特异性检测,利用标准质粒DNA检测最低下限拷贝浓度;在不同掺杂量组织中检测最低比例。结果表明,猪源性ddPCR检测体系特异强,在10~2000 copies/μL的范围内具有较高的检测线性,RSD值小于25%,可检测至猪肉掺杂量为1%的混合样品。基于ddPCR的检测猪肉掺假的方法具有较高的实际应用价值。