猪流行性腹泻病毒诱导Vero E6细胞凋亡的动态研究

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)诱导体外细胞产生病变及细胞凋亡的动态变化,本研究应用western blot、间接免疫荧光、细胞活性计数(CCK-8)等方法检测PEDV感染Vero E6细胞后不同时间点细胞内病毒含量、细胞活性、凋亡小体的形成,以及相关凋亡因子的变化。结果表明,感染后24 h细胞内病毒含量开始明显升高,48 h时达到峰值。同时在病毒感染24 h后出现明显的细胞病变,感染48 h后出现典型的凋亡特征,细胞聚堆,细胞核内染色质固缩,形成凋亡小体。CCK-8分析检测结果显示,与对照组相比感染病毒细胞活性明显降低。另外,western blot结果表明促凋亡因子蛋白水解酶Caspase-3在病毒感染过程中被活化。该研究结果进一步证实了PEDV感染可以诱导细胞凋亡,其中Caspase-3的激活在病毒诱导细胞凋亡的过程中发挥重要作用。

国内首株猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus)的分离鉴定

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新出现的猪冠状病毒,于2012年首次在香港的猪群中发现。2014年2月美国在腹泻仔猪和母猪的粪便中首次检测到PDCoV,随后,韩国和我国大陆也从腹泻猪的临床样品中检测到PDCoV。目前,只有美国成功分离到2株PDCoV。为分离鉴定PDCoV,本研究将PDCoV阳性样品无菌处理后接种猪肾细胞(LLC-PK)并连续传代培养。通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光和基因序列测定对细胞培养物进行鉴定。结果表明我们成功分离到国内首株PDCoV并将其命名为NH株。M基因的系统发育分析表明NH株与中国、美国及韩国的PDCoV亲源关系较近。本研究为进一步研究PDCoV的致病性和致病机制奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒IgA抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清特异性IgA抗体的间接ELISA方法,本研究利用融合PCR的方法,将PEDV G2型LNct2a株S蛋白的S1基因片段与人源IgG分子的Fc基因片段融合,克隆于真核表达质粒pAAV-IRES-hr GFP中,构建真核表达质粒pAAV-LNCT2-S1-Fc并转染293T细胞,表达并纯化了S1蛋白。以纯化的S1蛋白作为包被抗原,以羊抗猪IgA-HRP为二抗,通过优化反应条件,建立了检测PEDV G2型特异性IgA抗体的间接ELISA方法,并对该方法进行了特异性、敏感性及重复性试验。特异性试验结果显示该方法对猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒和圆环病毒的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验结果显示该方法能够检测出400倍稀释的阳性血清;批内和批间重复性变异系数均小于10%。利用该间接ELISA方法和间接免疫荧光方法(IFA)同时对临床样品检测,结果显示二者总符合率为98.6%。本研究建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,能够用于检测及评价血清中PEDV特异性IgA抗体的水平,为PEDV流行情况及免疫效果评价提供了有效的手段。

猪德尔塔冠状病毒S蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)S蛋白的单克隆抗体,本研究首先优化、合成了PDCoV NH株的S基因,利用PCR方法从中扩增S基因片段,克隆至pAAV-IRES-hrGFP真核表达载体,构建真核表达质粒pAAV-NH-S-Flag,转染至HEK293T细胞中进行表达。采用EZview Red ANTI-FLAG M2亲和凝胶蛋白纯化试剂盒进行纯化重组蛋白。将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株,利用Western blot和IFA鉴定单克隆抗体的特异性。结果显示:筛选获得两株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株17C7和23F3,单克隆抗体的亚型均为IgM,腹水效价均为1∶6400;两株单克隆抗体都与S蛋白有良好的反应性,且能够与PDCoV发生特异性反应,而与其他常见的猪腹泻冠状病毒不发生反应。本研究为PDCoV诊断及病毒入侵、感染机制的研究奠定了基础。

猪轮状病毒(G9型)TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立灵敏、特异的G9型猪轮状病毒(Po RV)Taq Man的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的G9型Po RV NMTL株的VP7基因保守区域设计一条特异性引物和探针。以104TCID50的病毒液所提取的总RNA进行10倍系列稀释作为标准品,通过对反应条件进行优化,建立了检测G9型Po RV的Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法的相关系数R2=0.991,对其它常见的Po RV(G5)、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒2型等猪病病原检测均为阴性,具有良好的特异性;该方法最低可以检测到的病毒滴度为10-3TCID50,比普通RT-PCR方法灵敏度高约1 000倍;组内和组间变异系数均小于0.87%,稳定性高,重复性好。对疑似感染Po RV的45份临床病料样品进行检测,结果表明,该方法阳性率(64.4%)高于普通RT-PCR(44.4%),两者总符合率为80%。本研究建立的方法为Po RV的流行病学调查和早期诊断奠定基础。

NPM1 K263 SUMO化位点在PEDV N蛋白与NPM1共定位中的作用

为阐明细胞核仁蛋白NPM1与猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N蛋白)共定位的关键位点。本实验通过设计突变引物,利用重叠延伸PCR方法对NPM1氨基酸位点T199、K230和K263进行定点突变,分别将其克隆至真核表达载体pDsRed2-N1中,获得重组质粒pDsRed2-NPM1(T199A)、pDsRed2-NPM1(K230R)、pDsRed2-NPM1(K263R)。随后分别将pDsRed2-NPM1(WT)、pDsRed2-NPM1(T199A)、pDsRed2-NPM1(K230R)、pDsRed2-NPM1(K263R)与重组质粒pAcGFP-N共转染VeroE6细胞。共聚焦结果显示NPM1(T199A)、NPM1(K230R)、野生型NPM1均与N蛋白共定位于细胞的核仁中。虽然NPM1(K263R)与N蛋白具有共定位现象,但两者共定位于细胞核中。该实验结果为进一步研究核仁蛋白NPM1参与PEDV复制的分子机制奠定了基础。

苹果公司营销模式创新研究

苹果产品对消费电子产业产生了推动性的影响。结合消费电子产品行业现状,提出PPC营销模式:产品策略、产品链策略、消费者体验策略,三者不可区分,作为一个整体实施对待。

Er、Zr及热处理对高锌铝合金组织和力学性能的影响

以Al-30Zn-3Cu-2.5Si高锌铝基合金为研究对象,探究稀土元素Er、Zr对铸态及热处理态合金组织和力学性能的影响,并分析和探讨了其作用机理。结果表明,当添加0.10%(质量分数,下同)Er和0.10%Zr元素后能够明显地细化合金晶粒,平均晶粒尺寸由74.28μm减小至60.01μm,且α-Al晶粒转变为细小的等轴晶。稀土元素Er、Zr的添加会在合金内部形成Al3(Er,Zr)细小的粒子并能够起到钉扎位错的作用,从而提高合金的力学性能。添加Er、Zr后,铸态合金的抗拉强度由未添加稀土元素的323.01 MPa提高到了358.29 MPa,提升了10.93%;屈服强度由309.33 MPa提高到了315.00MPa,提升了1.83%;延伸率基本未发生变化。合金经固溶时效热处理强化后,添加稀土元素合金的抗拉强度为449.48 MPa,屈服强度为408.51 MPa,比铸态合金分别提高了25.45%、29.68%。粗大的第二相存在于晶界处,导致合金的延伸率仍较差。

基于多维感知数据采集的城市快速路突发事件影响预测应用模型——以常州市为例

针对如何降低突发事件对域市快速路及周边路网的影响这一问题,利用多维感知采集和数据汇聚,实现对突发事件影响效率预测、流量蔓延预测,做到早发现、早预测、早干预,合理均衡域市高架等快速路以及周边道路流量、疏解道路拥堵、诱导车辆出行,充分发挥路网最大通行效率,降低突发事件对城市交通影响。

抗猪呼吸与生殖综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗猪呼吸与生殖综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法用纯化的重组Nsp9蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验分析单抗的特异性;使用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定单抗的亚类;将杂交瘤细胞分别保存1、2、3、4个月后复苏,采用间接ELISA法检测细胞分泌抗体的能力。结果共获得3株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2D6、3C11和4E6,其细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶6 400、1∶3 200和1∶1 600,腹水的ELISA效价分别为1∶640 000、1∶512 000和1∶256 000。3株单抗均可与Nsp9蛋白和PRRSV特异性结合;2D6和3C11株单抗的Ig亚型为IgG1,4E6株单抗为IgM亚类抗体;3株杂交瘤细胞保存4个月均能稳定分泌单抗。结论已制备抗PRRSVNsp9蛋白单克隆抗体,其特异性高,稳定性良好,为建立鉴别自然感染与注射疫苗感染PRRSV的诊断方法提供了材料。