发酵床养猪模式中垫料的主要菌群分析

为研究南方高热高湿地区发酵床养殖模式的微生态菌群分布,以四川邛崃、遂宁两大发酵床养猪场为研究对象,采集不同年龄阶段猪只肠道内容物及不同饲养阶段发酵床垫料进行细菌分离,对分离菌株进行动物致病性试验,并对致病菌进行耐药性分析。结果表明,不同年龄猪肠道以及发酵床分离细菌种类相同,但是细菌含量存在差异。主要分离菌有大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、黏液性枯草芽孢杆菌、普通枯草芽孢杆菌。小鼠致病性试验显示,大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、葡萄球菌为致病菌,黏液性枯草芽孢杆菌与普通枯草芽孢杆菌为有益菌。病原菌耐药性分析结果显示,分离到的4种病原菌仅对第3代头孢类药物(头孢曲松钠、头孢吡肟)敏感,对其他药物不敏感或敏感性低。可见,发酵床养猪模式的环境中存在大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌等致病菌的威胁,且致病菌的耐药性严重,一旦发病很难用药物控制。本试验结果可为发酵床养猪模式细菌性疾病控制提供参考。

猪NF-kappaB p65/p50基因克隆、序列鉴定及实时荧光定量PCR检测方法的建立

NF-κB信号通路在病毒感染、免疫损伤性疾病、肿瘤疾病中发挥重要作用,其活化水平常作为机体免疫应答水平、疾病发展进程的检测指标。为获得猪NF-κB p65/p50基因序列特征并建立体外定量检测其表达水平的实时荧光定量PCR方法,作者对猪NF-κB p65ORF和成熟p50编码区进行RT-PCR扩增、克隆、测序及生物信息学分析;设计特异性荧光定量引物,建立检测p65、p50实时荧光定量PCR方法。结果显示:所扩增的猪NF-κB p65ORF长1 662bp,编码553aa,成熟p50编码区长1 653bp,编码551aa;与不同动物的p65、p50序列相似性均较高;56.5%p65位于细胞核内,78.3%p50存在于细胞质中,p65、p50均无信号肽及跨膜区。荧光定量结果表明:起始模板与Ct值之间线性关系好,相关系数达到0.999,扩增效率均在95%左右;敏感性高,初始模板的检出下限达到101 copies.μL-1;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内变异系数均小于5‰。本试验为进一步研究猪NF-κB p65/p50生物学功能及其在猪相关疾病发生发展中表达量变化奠定了基础。

一起仔猪伪狂犬病的实验室诊断

2011年8月，四川某猪场仔猪发生严重的腹泻症状，猪只病初体温升高、下痢、厌食，精神不振，呼吸困难，继而出现神经症状，共济失调，倒地四肢划动，最后衰竭死亡，死亡率高。解剖后可见肝脏有明显的灰白色坏死灶，脑部充血明显。通过流行病学调查和临床症状可初步判定为伪狂犬病，但是无法确诊。无菌采集病猪的脑组织进行实验室病原检测，以弄清发病原因，提供更加丰富、完善的研究材料和临床依据。

猪NF-κB p65/p50亚基的原核表达及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响

为了研究经原核表达的猪细胞核转录因子NF-κB p65/p50融合蛋白对猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)体外增殖影响,本文采用RT-PCR技术扩增出编码成熟p50区和p65开放阅读框(ORF),将其克隆至pET21a(+)中,转化至Rosetta感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和蛋白免疫印迹法(Western-blot)对表达产物进行鉴定;纯化复性后添加到DMEM细胞维持液中,观察p65/p50对Marc145细胞毒性,确定最佳使用浓度;探讨最佳浓度的p65/p50对PRRSV体外感染增殖活力的影响,通过实时荧光定量PCR方法研究PRRSV感染时相,绘制PRRSV增殖曲线。成功构建了大量以包涵体形式表达Mr均约为70kD的p65/p50融合蛋白的p65/p50-pET21a(+)原核表达载体;Western-blot显示p50和p65重组蛋白可分别与兔抗人p50多克隆血清、兔抗人p65纯化抗体反应。确定p65/p50最佳添加浓度为0.4μg/mL。通过实时荧光定量PCR技术研究PRRSV感染时相,结果表明NF-κB p65/p50可促进PRRSV感染Marc-145CPE出现及病毒早期增殖;但CPE出现后,病毒增殖受到抑制,病毒滴度水平显著降低(P<0.05)。该结果为进一步研究PRRS的发病机理及治疗策略提供了新思路。

PRRSV体外感染Marc-145细胞对NF-κB p65/p50转录时相及核易位的影响

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染对细胞核转录因子-κB(NF-κB,p65/p50)mRNA转录时相及核易位的影响,探讨PRRSV感染导致的免疫抑制与NF-κB的活化异常是否有一定的相关性,运用实时荧光定量PCR技术对PRRSV感染Marc-145细胞不同时期NF-κB p50、p65mRNA的转录水平变化进行定量分析,并提取不同感染时期Marc-145细胞核蛋白,利用免疫印迹法检测细胞核内具有活性的p50、p65水平变化。荧光定量结果表明,Marc-145细胞感染PRRSV后第8～12小时,p50、p65转录水平急剧下调,第12～120小时p50、p65mRNA含量一直维持在较低水平,与接毒前及对照组同时期的转录水平相比,差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)。免疫印迹结果表明,Marc-145细胞感染PRRSV后第12～96小时,细胞核内均未检测到p50的表达;感染后第12小时,细胞核内p65表达下调,第48～96小时未检测到p65的表达。可见,PRRSV体外感染Marc-145细胞能够抑制NF-κB p65/p50mRNA的转录及核易位。以上结果支持PRRSV感染早期无力的先天性免疫应答可能与NF-κB活化水平的低下有关的观点,为进一步研究PRRS的感染机制及NF-κB的功能提供新的思路和依据。

复方中药制剂“肤螨灭”对牛毛虱的体外杀灭作用及其疗效研究

为了探索复方中药制剂"肤螨灭"对牛毛虱的杀灭作用及临床疗效,试验采用平皿药膜法,测定含原药27.16,13.58,6.79,3.40,1.70,0.85 mg/mL 6个浓度梯度的"肤螨灭"对牛毛虱的离体毒性,并以敌百虫、伊维菌素、氯氟氰菊酯作为阳性对照,观察、记录不同时间段毛虱的死亡数(存活数)及对患毛虱病黄牛的疗效。结果表明:"肤螨灭"的体外杀虱活性明显高于1%的敌百虫,含原药6.79 mg/mL的"肤螨灭"与0.5%伊维菌素、0.004%氯氟氰菊酯的效果无明显差异;选择此浓度(6.79 mg/mL)进行临床治疗观察,用药3 d后未见活动的牛毛虱存在,且2周后观察未见复发。说明"肤螨灭"对离体牛毛虱有很好的杀灭效果,临床治疗黄牛虱病效果确实。

猪嵴病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一步法检测猪嵴病毒的实时荧光定量PCR检测方法,通过对猪嵴病毒3D区的PCR扩增后,连入pMD19-T载体,制备阳性标准品,进行实时荧光定量PCR。结果显示,该方法能检测出的最低拷贝数为100拷贝,扩增效率为91.8%,相关系数r2=0.992。通过对扩增曲线、熔解曲线等试验数据的分析,得出该检测方法具有良好的稳定性和较高的精确度。本研究建立的实时荧光定量PCR为一种可靠的猪嵴病毒检测方法。

猪巨细胞病毒四川株gB基因的克隆表达及抗原性分析

为研究猪巨细胞病毒(PCMV)SC株gB蛋白的免疫学活性,采用PCR扩增PCMV SC株gB全基因和不含跨膜区及信号肽的gB基因片段,将后者克隆至pET-30a(+)载体,转化Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导以获得高效表达。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,分别用琼脂扩散试验和Western-blot对多克隆抗体和复性的gB蛋白进行检测。结果显示,扩增的PCMV gB基因全长2 580bp,编码860个氨基酸。与国内外参考株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为97.8%～99.5%和96.6%～99.0%;与其他9株β疱疹病毒核苷酸和氨基酸序列相似性分别为33.3%～41.4%和13.3%～49.4%;系统进化分析显示,PCMV与人疱疹病毒6型和7型属于一个分支。gB肽链N端1～23位氨基酸为信号肽,729～751位氨基酸间含有跨膜区。构建的表达载体pET30a-gB-B在Rosetta(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导后以包涵体形式表达出大小约80ku的蛋白。所制备的血清琼扩抗体效价为1∶16,Western-blot显示重组gB蛋白可与PCMV阳性猪血清反应。结果表明,PCMV gB基因较为保守,与国内外不同地区的PCMV毒株具有较高的相似性,所表达的重组蛋白具有很好的抗原性。

猪NF-κB真核表达载体的构建及转染Marc-145细胞对PRRSV增殖的影响

为研究猪细胞核转录因子-kappa B(NF-κB,p50/p65)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外增殖的影响,从猪外周血淋巴细胞扩增NF-κB p65ORF和p50RHD功能区,分别克隆至pcDNA3.1(+),经酶切及测序鉴定,获得pcDNA3.1(+)-p50-RHD及pcDNA3.1(+)-p65。将其转染至Marc-145细胞,Western-blot检测胞核内p50、p65的表达水平。pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-p50-RHD、pcDNA3.1(+)-p65和pcDNA3.1(+)-p50-RHD+pcDNA3.1(+)-p65分别转染Marc-145,18h后接种PRRSV,采用实时荧光定量PCR检测培养上清病毒粒子增殖时相,绘制一步生长曲线。结果表明,成功构建了猪NF-κB p50、NF-κB p65真核表达载体,且可在Marc-145细胞中表达。转染p50+p65、p65真核表达质粒可加速PRRSV感染Marc-145细胞后CPE进程,抑制PRRSV增殖,极大降低病毒效价,且p50+p65抑制作用更强;转染p50质粒则推迟CPE出现,减缓PRRSV增殖,但对病毒效价影响不大。本研究结果表明,NF-κB p50/p65、p65/p65对PRRSV在Marc-145细胞中的增殖有一定的抑制作用。

冬初养牛3关键

补充维生素A秋末冬初青草开始木质化,粗纤维增多,而胡萝卜素的含量大大降低。在进行圈栏强度育肥时,肉牛迅速增重,维生素A的需要量增加。因此。