基于蛋白组学分析旋毛虫原肌球蛋白过表达对小细胞肺癌NCI-H446细胞蛋白组分的影响

目的研究旋毛虫原肌球蛋白(tropomyosin,Tm)过表达对人小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)NCI-H446细胞蛋白组分的影响。方法本研究通过串联质谱标记(Tandem mass tags,TMT)技术结合生物信息学分析旋毛虫Tm过表达对NCI-H446细胞蛋白组分的影响。比较旋毛虫Tm(Tm-pcDNA3.1)过表达和转染空载体(pcDNA3.1)48 h后NCI-H446细胞的蛋白组分,利用Uniprot数据库检索差异表达蛋白(Differentially expressed protein,DEPs)并对所得DEPs进行基因本体论(GO)富集分析。从STRING数据库获得DEPs相互作用数据,利用Cytoscape 3.9.0软件构建蛋白互作网络并筛选中心节点蛋白。通过Western blot对随机选取的中心节点蛋白NDRG1进行验证。结果旋毛虫Tm转染NCI-H446细胞48 h后,筛选出DEPs 70个,其中34个上调,36个下调;GO功能富集分析显示,DEPs主要涉及转录后的调控、免疫应答的调节等生物学功能;分析蛋白互作网络获得5个下调的中心节点蛋白:细胞周期蛋白G相关激酶(GAK)、组蛋白H3-7(H3-7)、辛普勒金Symplekin(SYMPK)、N-myc下游调节因子1(NDRG1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶N2(PKN2);Westrne blot结果显示旋毛虫Tm降低NCI-H446细胞中NDRG1的表达。结论旋毛虫TM能引起NCI-H446细胞蛋白组分的显著变化;旋毛虫Tm可能通过下调NCI-H446细胞中GAK、H3-7、SYMPK、NDRG1、PKN2的表达发挥其生物学作用。

旋毛虫原肌球蛋白的特性分析及原核表达

目的 分析旋毛虫(Trichinella spiralis)的原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)特性并制备重组旋毛虫TM蛋白。方法 在NCBI的Nucleotide数据库选取旋毛虫TM (GenBank:AF419300.1),利用在线分析工具分析旋毛虫TM的氨基酸组成、二级/三级结构、疏水性等特性。密码子优化后合成旋毛虫TM(GenBank:AF419300.1)的全长并插入到原核表达载体pET-28a(+),构建重组原核表达质粒pET-28a(+)-TM,转化至BL21(DE3)中,以终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导旋毛虫TM的表达,纯化后采用Western blot法对重组旋毛虫TM蛋白进行鉴定。结果 旋毛虫TM为亲水性不稳定蛋白,二级结构以α-螺旋为主,无复杂的空间结构。构建的重组原核质粒pET-28a(+)-TM经双酶切得到867 bp的基因片段,序列测定后证实重组原核质粒pET-28a(+)-TM构建正确。经IPTG诱导的菌体超声混悬液、离心后上清均检测到相对分子质量约40×10~3的目的蛋白,纯化后得到条带单一的旋毛虫TM。Western bolt显示纯化的重组旋毛虫TM具有良好的反应原性,能被相应抗体识别。结论 获得具有反应原性的纯化的重组旋毛虫TM,该蛋白为亲水性不稳定蛋白,无复杂空间结构,为进一步研究旋毛虫TM蛋白的生物学功能奠定了基础。