土壤分离转谷氨酰胺酶生产菌株

根据转谷氨酰胺酶催化反应结果的特性 ,设计了一个利用廉价的酶作用底物实施的蛋白质交联凝絮 -沉淀性能测定方法 ,并将其作为初筛手段 ,用于从土壤中分离生产转谷氨酰胺酶微生物菌种。从 13 9株放线菌中经初筛和摇瓶发酵测定酶活的复筛试验筛选得到 10株产酶菌株 ,其中一株酶活达 0 2 4U/mL ,并对其进行分类鉴定实验 ,确定为链霉菌属 ,编号为Streptomycessp .WZFF .W 12。

链霉菌生产谷氨酰胺转胺酶的发酵工艺条件研究

以本实验室从土壤分离并经诱变筛选得到的链霉菌 Streptomyes sp.WZFF.W—12.var MN-35为出发菌株, 首先在摇瓶条件下,对微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)发 酵生产过程中的主要培养基组成、培养条件及各种蛋白 酶抑制剂对菌体生长和产酶能力的影响进行了研究。结 果表明,发酵生产MTG的合适碳氮源分别为可溶性淀 粉与葡萄糖和多价胨,其最佳碳氮比(C/N)为5:5,适宜 的接种龄、接种量、初始pH、培养温度、搅拌速度等工艺 条件分别为24h、7％～10％、pH6.5～7.0、30℃和200r/min, MTG酶活最高可达1.63U/mL。当在优化培养基中进一 步加入一种蛋白酶抑制剂后,酶活又提高了19.0％。在这 些最佳工艺条件下采用简易的小型生化反应器培养该链 霉菌株,酶活稳定在2.0U/mL以上。

多维离子交换色谱分离和串联质谱鉴定在小鼠肝脏膜蛋白质组分析中的应用

膜蛋白质在变性剂作用下能够较充分地溶解。根据这一特点,我们试图在变性剂溶液中采用串联离子交换色谱法分离小鼠肝脏膜蛋白质。将小鼠肝脏膜蛋白质溶解于含有4mol/L尿素,20mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH9.0)中,用Q-SepharoseFF和SephacrylS-200HR树脂组成的色谱柱结合大部分溶解的膜蛋白质,然后采用氯化钠线性梯度洗脱蛋白质,分步收集后采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进一步分离洗脱组分的蛋白质。利用胶内胰蛋白酶消化技术将SDS-PAGE胶内分离的蛋白质降解为相应的肽段,然后以反相高效液相色谱分离和离子阱质谱仪鉴定肽段。根据文献报道和蛋白质的功能分类,在所鉴定的392个蛋白质中有306个可能为膜蛋白质或膜结合蛋白质。蛋白质的疏水性计算表明,GRAVY(grandaverageofhydropathicity)得分大于或等于0.00的蛋白质有83个。综上所述,我们有理由认为本实验方法基本符合小鼠肝脏膜蛋白质组学研究的要求。

微生物转谷氨酰胺酶的生产菌种诱变和发酵生产分析

对本研究室从土壤分离得到的链霉菌(Streptomyces sp.)WZFF.W-12菌株的斜面孢子预培养处于初萌发状态后,以亚硝基胍(NTG)进行诱变育种试验,并根据诱变处理后菌落的某些形态变化状况与产酶能力相结合的特征。初步判断产酶性能,挑选高酶活菌株,再经过初筛和复筛,获得一性能良好的产酶突变菌株WZFF.W-12.varMN-35,转谷氨酰酶活达0.53 U/mL,比原始菌株提高了1.2倍。然后在摇瓶条件下,对其发酵过程中的主要培养基组成及各种培养条件对菌体生长和产酶的影响作用进行了研究,结果表明该菌株发酵生产转谷氨酰酶的适宜碳源为可溶性淀粉+葡萄糖,氮源是多价胨外加少量的酵母膏,优化工艺条件为种龄时间24 h、接种量10％、初始pH值6.5、温度30℃和搅拌速度200 r/min,产酶能力显著提高,用小型生化反应器可以稳定生产2.0U/mL以上的酶产品。

链霉菌WZFF.L-M1搭载“神舟”四号飞船的空间育种效果

生产微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)链霉菌WZFF.L-M1(酶活2.62U/mL)的孢子和斜面培养菌体搭载“神舟”四号无人飞船,并在斜面中添加诱变剂亚硝基胍(NTG)。实验发现,搭载菌株的菌落形态发生变异,并与产酶能力有一定相关。通过对搭载菌株的初筛与复筛的菌种选育驯化,获得一系列产酶能力大幅度提高的优良突变菌株。其中的3株性能优异,遗传性状稳定,产酶活力提高了30%以上,能够稳定发酵生产高于3.5U/mL的MTG,集中体现了航天飞船搭载的空间诱变育种技术效果。

微生物谷氨酰胺转胺酶生产菌株的育种研究

在简要介绍微生物谷氨酰胺转胺酶的主要功能、应用和国外研究成果与目前状况后 ,指出该酶生产微生物菌种选育的重要性以及实际难度和艰巨性 ,阐述了进行初筛、复筛和常规诱变育种试验的关键技术手段及其成果效益。利用这些有效方法获得性能优良的高产酶突变菌株 ,进行规模化发酵工艺条件和酶制剂产品分离提纯技术研究 ,并在此基础之上 ,进一步开展通过“神舟”四号飞船搭载的微生物空间诱变育种研究强化产酶菌株的各种优良性能 ,说明了空间多种复合因素引发的综合搭载效果显著。

产转谷氨酰胺酶链霉菌的发酵罐生产工艺研究

针对研究室分离筛选的链霉菌 (Streptomycessp )WZFF W 12 varMN 3 5发酵生产微生物转谷氨酰胺酶 (MTG) ,首先采用自行设计的 2L小型生化反应器 ,研究以多价胨为主的有机氮源的影响作用 ,并在此基础上逐级扩大发酵罐规模 ,以 8L小型罐及 2 0～ 2 0 0L发酵罐组合并利用在线监控手段直接监测分析环境条件对MTG发酵过程中菌体生长和产酶的影响 ,进一步确定培养条件。研究结果表明 ,以 2 0 0L发酵罐发酵生产MTG时采用两级种子培养 ,氮源采用多价胨和豆饼粉 ,发酵过程中在线控制通气量和搅拌速度分别为 0 9～ 1 1vvm和 3 5 0～ 45 0r/min等优化条件最有利于菌体持续稳定生产MTG ,当发酵至 72h时酶活达到最高 ,在 2

微生物谷氨酰胺转胺酶高产菌株的诱变选育

以本实验室筛选的Streptomyces sp.WZFF.W-12(谷氨酰胺转胺酶活0.24U/ml)为出发菌株,孢子经预培养处理处于萌发状态后制备成单孢子悬浮液,用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG)单独和结合羟胺进行多次复合诱变处理。实验发现,诱变处理后菌落的形态变异等特征与产酶能力呈相关关系,并被用于最初的突变菌落挑选。接着先后采用蛋白质交联凝絮-沉淀性能分析的初筛试验和摇瓶测定酶活的复筛试验分离选育高产酶突变菌株,最后获得一产酶活力达2.18U/ml的高产菌株W-12var HZ3,酶活相对提高了8倍。对该菌株进行分类鉴定方面的理化性能测试和传代实验结果表明,该菌遗传性较为稳定,而且其理化性能与已报道的产酶菌种明显不同。

微生物谷氨酰胺转胺酶的分批发酵生产

在首先采用我们自行设计的2L小型、便易的生化反应器,对我们研究室保藏的高产酶菌株链霉菌(Streptomyces sp.)WZFF.L-M168发酵生产微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)过程中发酵培养基的碳源、氮源和初始pH值的影响作用进行研究,确定培养条件后,逐级扩大发酵罐规模,在20L和200L发酵罐上以在线监控技术手段直接监测分析环境因素对MTG发酵生产的作用效果,确立各级发酵罐分批发酵的生产工艺条件。结果表明:碳氮源采用葡萄糖、淀粉和多价胨,初始pH值为7.0,接种量5%～10%,发酵过程中在线控制培养温度、pH、通气量和搅拌速度等各项参数指标分别为30±0.5℃、6.6～6.9,0.8～1.1vvm和200～400r/min较为适宜。在这优化技术条件下,200L发酵罐可以稳定生产酶活在2.75U/ml以上的MTG。

SYNAPT G2 HDMS高清质谱性能特点及应用简介

SYNAPT^(TM) G2 HDMS质谱分析系统是沃特世公司第二代基于高效离子淌度(ion mobility spectrometry,IMS,也称离子迁移)技术的高性能四极杆-飞行时间质谱仪。通过两种技术的结合与升级,SYNAPT G2 HDMS不仅能按离子的质荷比分离检测,还可根据离子的大小、形状等将其分离。因此,此质谱系统不但可以提高传统质谱数据的准确性,更可以提供样品形态信息,从而得到样品活性、结构状态等信息。其在蛋白组学、代谢组学、糖及脂类分析、医学标志物发掘、药物开发与质控、食品安全检测、环境安全检测等方面有着广泛的应用空间,并已经表现出良好的性能优势,成为各领域工作者的有力的分析工具。本文简要介绍该系统的性能特点及应用。

一种治疗用抗体偶联药物电荷异构体的分离和表征

目的探究一种治疗用抗体偶联药物NCB001电荷异构体结构及其对生物学活性的影响。方法采用阳离子交换色谱对NCB001电荷异构体组分进行分离和收集,通过液质联用(LC⁃MS/MS)技术进行结构表征,并进一步考察其生物学活性。结果分离获得的3种电荷异构体纯度较高(接近90%)、相对分子质量正确;3种电荷异构体发生翻译后修饰的位点相同,但与主峰相比,酸性峰中天冬酰胺的脱酰胺化修饰比例显著增高,碱性峰中重链C端甘氨酸缺失后脯氨酸的酰胺化修饰的比例明显升高,并且偶联毒素小分子药物比例明显降低;其他翻译后修饰比例无显著差异。同时,3种电荷异构体之间结合活性和细胞活性无显著差异。结论电荷异质性不会影响NCB001的生物学活性,3种电荷异构体均应视为合格的药物有效成分。