基线中性粒细胞与淋巴细胞比值对晚期肿瘤免疫治疗早期疗效的预测价值

目的探讨中性粒细胞与淋巴细胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio,NLR)对无法检测PD-L1表达水平、肿瘤突变负荷(tumor mutation burden,TMB)、微卫星高度不稳定(microsatellite instability-high,MSI-H)等晚期肿瘤患者免疫治疗早期疗效的预测价值。方法回顾性选择2020年1月至2021年12月上海交通大学医学院附属第九人民医院接受PD-1单抗治疗的48例无法检测PD-L1表达水平、TMB、MSI-H等的晚期肿瘤患者,采用logistic多因素分析评估患者年龄、性别、原发肿瘤部位、免疫治疗方式及NLR与早期治疗疗效的相关性。通过ROC曲线分析基线NLR预测疾病控制状态的最佳截断值。根据NLR最佳截断值,将患者分为高NLR组(n=28)和低NLR组(n=20),比较两组免疫治疗早期疗效。结果Logistic多因素分析显示,基线NLR与免疫治疗早期疗效独立相关(P=0.009)。NLR预测免疫治疗早期疗效的最佳截断值为3.54。低NLR组和高NLR组患者的客观缓解率分别为20.0%和7.1%(P=0.003),疾病控制率分别为85.0%和35.7%(P=0.001)。结论在晚期肿瘤患者中,基线NLR对PD-1单抗早期疗效具有潜在预测价值。

STAT3、pSTAT3、VEGF和bFGF在非小细胞肺癌中的表达

目的探讨信号转导及转录活化因子3(STAT3)及其磷酸化形式pSTAT3与血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及关系。方法应用免疫组织化学方法检测68例NSCLC和27例正常肺组织中STAT3、pSTAT3、VEGF、bFGF的表达,并分析其与各临床病理参数之间的关系。结果STAT3、pSTAT3、VEGF、bFGF在NSCLC组织的阳性表达率均高于正常肺组织(P<0.05);NSCLC中pSTAT3、VEGF、bFGF三者之间的表达呈正相关(P<0.05)。STAT3、pSTAT3在低分化NSCLC中的表达高于中、高分化者,在TNM Ⅲ+Ⅳ期NSCLC中的表达高于Ⅰ+Ⅱ期,有淋巴结转移者高于无淋巴结转移者,差异均有统计学意义(P<0.05)。VEGF、bFGF在TNM Ⅲ+Ⅳ期NSCLC中的表达高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05),有淋巴结转移者VEGF表达高于无淋巴结转移者(P<0.05)。结论STAT3、pSTAT3、VEGF和bFGF在非小细胞肺癌中高表达,并与肿瘤的侵袭和转移有关。

血浆EGFR基因突变指导进展期肺腺癌的靶向治疗

目的:研究进展期肺腺癌患者血浆中EGFR基因突变与小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)吉非替尼(gefitinib,又称易瑞沙Iressa)治疗进展期肺腺癌患者疗效间的关系。方法:选择上海交通大学医学院附属第三人民医院肿瘤科一线治疗失败后的44例进展期肺腺癌患者(男32例,女12例)和15位健康志愿者(男11例,女4例)。采集受试者血浆,利用改良酚-氯仿方法提取血浆DNA,利用突变富集型PCR(mutatant-enriched PCR,ME-PCR)扩增EGFR基因外显子19和21,然后进行基因测序。分析肺腺癌患者EGFR基因突变与与患者年龄、性别、吸烟史、体力状况(performance status,PS)评分、临床分期、是否接受放疗、一线化疗周期数间的关系,Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析EGFR基因突变组与EGFR野生型组接受吉非替尼治疗的PFS和疗效差异。结果:44例肺腺癌患者血浆中有13例检出EGFR基因突变,其中外显子19缺失突变8例、外显子21点突变5例;健康对照组中未发现EGFR基因突变。肺腺癌患者EGFR基因突变与患者性别、吸烟史相关,与患者年龄、PS评分、分期、是否接受放疗及化疗周期数无关。EGFR基因突变的肺腺癌患者经吉非替尼治疗后中位无疾病进展时间(PFS)明显长于无EGFR突变患者(8个月vs3.7个月,P=0.008)。结论:进展期肺腺癌患者血浆中EGFR基因突变检测可以作为分子靶向药物治疗的参考。

Foxm1对非小细胞肺癌中MMP-2、MMP-9和迁移侵袭的影响

目的:研究Foxm1在非小细胞肺癌中对基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和细胞迁移侵袭能力的影响。方法:Western blot和RT-PCR方法检测Foxm1表达不同的肺癌细胞中MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA的表达水平。采用小干扰RNA技术下调H1299细胞中Foxm1的表达,Transwell实验观察Foxm1对非小细胞肺癌细胞迁移浸润能力的影响。结果:Foxm1高表达的H1299细胞中,MMP-2、MMP-9在蛋白和mRNA的表达水平明显高于Foxm1低表达的H1650细胞。而且,Transwell实验中H1299细胞和H1650细胞系穿透到Transwell小室下面的细胞数分别为26.8±4.0和7.8±2.0,铺基质胶后穿透到Transwell小室下面的细胞数分别为8.7±1.1和2.5±1.4,差异均具有统计学意义。转染特异性Foxm1 siRNA后,MMP-2、MMP-9在蛋白和mRNA的表达水平随着Foxm1表达的下降而明显降低。结论:Foxm1可能通过调节MMP-2、MMP-9的表达,促进非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭。

Foxm1对非小细胞肺癌细胞迁移、浸润的影响

目的:探讨Foxm1在非小细胞肺癌细胞EMT过程中的作用进而研究其对非小细胞肺癌细胞迁移和浸润能力的影响。方法:采用Western blot和RT-PCR技术检测不同非小细胞肺癌细胞系中Foxm1和EMT相关因子的表达水平。小RNA转染技术干扰H1299细胞中Foxm1的表达。Transwell试验观察Foxm1对非小细胞肺癌细胞迁移浸润能力的影响。结果:Foxm1在四种非小细胞肺癌细胞中均有表达,且H1299表达量相对较高,H1650表达量相对较低。分别以上述两种细胞为试验对象,结果显示Foxm1的表达与EMT相关分子E-cadherin、Vimentin的表达呈明显相关性。CCK-8结果显示:Foxm1抑制剂Thiostrepton处理72h后对H1299、H1650的IC50值分别为1.21μmol/L和3.08μmol/L。Thiostrepton处理和干扰后,Foxm1和Vimentin的表达量明显下降。Transwell小室迁移试验24h后,空白组、阴性对照组和干扰组穿膜细胞数分别为42.6±6.9,36.3±4.2,4.6±1.1;侵袭试验24h后,空白组、阴性对照组和干扰组穿膜细胞数分别为12.3±3.4,10.0±1.4,3.1±2.6。结论:Foxm1在非小细胞肺癌细胞中可能通过调节EMT进程来促进肿瘤细胞的迁移和浸润能力。

PI3K/AKT信号通路参与AG1478对肺癌细胞中FOXO3a分子的上调及核转位

目的:探讨表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)AG1478对非小细胞肺癌细胞(NSCLC)中叉头转录因子O3a(FOXO3a)表达及其在细胞核质分布的调控及分子机制。方法:Western blot法检测AG1478及EGFR下游信号通路抑制剂LY294002、U0126、AG490作用后A549细胞中FOXO3a的表达及其在细胞核质分布情况。瞬时转染AKT、FOXO3a小干扰RNA(siRNA),RT-PCR及Western blot检测转染效率及相关蛋白的表达改变。结果:AG1478呈时间依赖性诱导FOXO3a表达上调并促进其核转位。与U0126、AG490相比,PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002呈时间依赖性抑制p-FOXO3a的表达,促进其核转位;沉默AKT后,p-AKT及p-FOXO3a分子的表达明显下调。结论:AG1478可能通过PI3K/AKT信号通路上调FOXO3a的表达并促进其核转位,进而下调FOXM1及下游增殖蛋白的表达,抑制肺癌细胞的增殖,提示FOXO3a为肺癌治疗及药物开发的重要靶点。

EGFR-AKT信号通路下调肺癌细胞miR-145的表达

目的:研究人肺癌细胞中EGFR的活化对miR-145表达的影响及其可能的分子机制。方法:选择人肺癌细胞株H1975,采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测细胞中miR-145的表达水平和EGFR的活化水平。分别以EGF、特异性EGFR酪氨酸激酶抑制剂AG1478、AKT小分子抑制剂LY294002和AKT siRNA处理H1975细胞,观察细胞miR-145的表达情况。结果:肺癌细胞中活化的EGFR下调miR-145的表达,EGF可下调肺癌细胞内miR-145表达,AG1478可逆转EGFR活化所诱导miR-145的下调。EGFR活化后激活下游信号蛋白分子AKT,LY294002抑制AKT活化而恢复EGFR活化所诱导的miR-145下调。AKT siRNA下调AKT蛋白表达,降低pAKT的表达,进而上调miR-145表达。结论:在肺癌细胞中,EGFR可通过AKT信号分子下调miR-145的表达。

骨桥蛋白在淋巴结转移的非小细胞肺癌中的表达

目的研究骨桥蛋白(OPN)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达。方法应用组织芯片免疫组织化学方法检测226例肺癌组织(无淋巴结转移116例,淋巴结转移110例)和25例正常肺组织中OPN的表达,并进行比较分析。结果226例肺癌组织中OPN表达阳性84例(37.2%),其中51例为有淋巴结转移的肺癌组织,33例为无淋巴结转移的肺癌组织;正常肺组织中无OPN表达。结论OPN在有淋巴结转移的NSCLC组织中表达增高,提示其在NSCLC的转移中起重要作用。

FasL基因修饰树突状细胞的抗白血病作用及其机制

目的:选择性去除骨髓移植物中异基因反应性淋巴细胞,特异性抑制移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)并保留移植物的抗白血病(graft versus leukemia,GVL)作用。方法:分别把未经处理的、溶T淋巴细胞处理的和以FasL基因修饰树突状细胞(FasL-DC)处理的3组小鼠骨髓细胞移植物移植给已经接种P815肿瘤细胞的BALB/c受体小鼠,然后观察比较各组小鼠存活情况,并用51Cr释放法检测移植后2个月受体小鼠T淋巴细胞的CTL活性。结果:致死剂量(9Gy)照射的白血病受体鼠在接受经FasL-DC处理的供体骨髓细胞移植后,生存期显著延长,2个月时生存率为40%,对照组在1个月内全部死亡。51Cr释放法检测证实,FasL-DC处理组的T淋巴细胞对P815细胞保持较强的杀伤活性。结论:转染FasL基因的DC可有效去除骨髓移植物中异基因反应性T淋巴细胞,移植用该方法处理过的骨髓,不但能够有效抑制GVHD的发生,同时也可以保留移植物的抗肿瘤作用。

骨髓间充质干细胞对小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的作用

目的研究骨髓间充质干细胞(MSCs)对小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤的影响。方法自C57BL/6小鼠骨髓分离MSCs,制备单细胞悬液并于体外传代培养,取第4～5代细胞用于实验。56只C57BL/6小鼠经Lewis肺癌细胞皮下接种建立小鼠肺癌皮下移植瘤模型,根据MSCs给予时间分为D0组(接种同时给予MSCs)和D10组(接种后第10天给予MSCs),其中D0组分为3个亚组(n=8):组1单纯接种肿瘤细胞,组2肿瘤细胞和MSCs共同接种,组3肿瘤细胞接种及尾静脉注射MSCs;D10组分为4个亚组(n=8):组4(肿瘤细胞接种及瘤体内注射MSCs)及其等量PBS对照组(组5),组6(肿瘤细胞接种及尾静脉注射MSCs)及其等量PBS对照组(组7)。观察各组移植肿瘤的生长情况,包括肿瘤形成时间及不同时间点的瘤体大小,并进行组间分析比较。结果与组1和组3比较,组2的肿瘤形成时间明显缩短(P<0.05);而各时间点三组瘤体大小比较,差异无统计学意义(P>0.05)。组4的瘤体显著大于其对照组(P<0.05);而组6与其对照组的瘤体大小比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论MSCs与Lewis细胞同时接种可加速小鼠肺癌皮下移植瘤形成,而成瘤后MSCs瘤体内注射具有促进移植瘤生长的作用。

Thiostrepton介导FOXM1下调对非小细胞肺癌细胞生长及其AG1478药物敏感性的影响

目的:探讨硫链丝菌素(thiostrepton,TST)对肺癌细胞A549增殖及其对AG1478药物敏感性的影响。方法:CCK-8法检测TST、AG1478单药及两药联用后A549细胞的增殖抑制率;Western blot检测不同浓度TST对A549细胞中FOXM1的表达影响;利用RNAi技术沉默A549细胞中FOXM1基因,RT-PCR及Westernblot检测转染效率;集落形成实验检测转染前后细胞集落形成能力的改变。结果:TST明显抑制A549细胞增殖并提高其对AG1478的药物敏感性。TST呈剂量依赖性抑制FOXM1、c-myc、CyclinB1及Bcl-2表达;与对照组相比,FOXM1 siRNA转染组的FOXM1 mRNA及蛋白表达均下降,其下游c-myc、Bcl-2的表达下降,Cleaved-PARP的表达明显上调;转染组集落数为(32.0±3.0)个,明显低于空白组及阴性对照组(NC)[集落数分别为(146.0±4.6)个、(128.7±5.7)个],P<0.05。转染组及NC组细胞集落形成抑制率分别为78.08%、11.87%,转染后细胞的集落形成能力明显降低(P<0.05);AG1478单药组的IC50值是TST与AG1478联用组的5.96倍,P<0.05。结论:TST可能通过下调FOXM1的表达抑制A549细胞的增殖、诱导其凋亡,并增加其对AG1478的药物敏感性。

肺腺癌患者血浆及尿中表皮生长因子受体突变研究

目的:分析血浆和尿中进行表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变检测的可行性。方法:利用改良酚-氯仿方法从血浆和尿中提取DNA,突变富集型PCR技术扩增EGFR外显子19和21,进行基因测序。结果:60例进展期肺腺癌患者中,血浆中检测出12例EGFR突变,其中外显子19缺失突变7例,外显子21点突变5例,尿标本中未检测出突变。血浆EGFR突变与性别相关,与年龄、吸烟史无相关。结论:在进展期肺腺癌患者血浆标本中可检测出EGFR突变,尿标本中未检测出EGFR突变。

抑制JAK2/STAT3信号通路对肺癌细胞A549中HIF-1α、VEGF和miRNA-145表达的影响

目的探讨抑制Janus蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)/信号转导和转录激活子3(STAT3)信号通路对人肺腺癌细胞株A549中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)和微RNA145(miRNA-145)表达的影响。方法采用Western blotting和RT-PCR技术检测经不同浓度Jak2/STAT3特异性抑制剂AG490处理或转染靶向STAT干扰小RNA(siRNA)A549细胞(AG490组和siRNA-STAT组)中HIF-1α、VEGF和miRNA-145蛋白和mRNA的表达变化。以未经AG490处理及未转染细胞作为空白对照组,转染无关序列siRNA细胞作为阴性对照组。结果与空白对照组比较,AG490组A549细胞中miRNA-145的表达显著上调(P<0.05),HIF-1α和VEGF蛋白和mRNA的表达随着AG490浓度的增高而逐渐降低。与空白对照组和阴性对照组比较,siRNA-STAT组A549细胞中STAT3蛋白、磷酸化STAT3蛋白的表达及HIF-1α、VEGF mRNA的表达明显下调,而miRNA145的表达显著升高(P<0.05)。结论在人肺腺癌细胞A549中,抑制JAK2/STAT3信号通路可使miRNA-145的表达上调,而HIF-1α和VEGF的表达下调。

JAK2/STAT3信号通路对A549细胞株中HIF-1ɑ、VEGF蛋白表达的影响

目的:研究人肺腺癌细胞A549细胞中JAK2/STAT3信号通路对HIF-1ɑ、VEGF蛋白表达的影响。方法:AG490处理在氧含量正常及缺氧条件下(Co Cl2200μmol/L)48h后Western blot法测定A549细胞中HIF-1ɑ、VEGF蛋白表达变化(分组为对照组、AG490 50μmol/L、AG490 100μmol/L、Co Cl2、Co Cl2+AG49050μmol/L和Co Cl2+AG490 100μmol/L组)。IL-6(3.85nmol/L)处理A549细胞24h后,检测细胞中STAT3、p-STAT3、HIF-1ɑ、VEGF蛋白表达变化(分组为对照组,IL-6组)。结果:JAK2特异性抑制剂AG490作用48h后,相对于对照组AG490能够下调HIF-1ɑ、VEGF的蛋白表达,且呈浓度依赖性;随浓度的升高,抑制作用更明显。缺氧条件下(Co Cl2200μmol/L)能够上调HIF-1ɑ、VEGF的蛋白表达。AG490也能够下调Co Cl2诱导的HIF-1ɑ、VEGF的蛋白表达,且呈浓度依赖性,随浓度的升高,抑制作用更显著。IL-6能够上调HIF-1ɑ、VEGF的蛋白表达。结论:在人肺腺癌细胞A549细胞中,缺氧可上调HIF-1α和VEGF蛋白表达。JAK2/STAT3信号通路对HIF-1α和VEGF蛋白的表达具有调节作用。

Rab1A对NSCLC细胞迁移和JAK1磷酸化的影响

目的:观察Rab1A(Ras-related protein Rab-1A)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞系迁移的影响及其分子机制。方法:应用siRNA干扰Rab1A基因表达;应用RTCA(real-time cell analysis)法分析干扰Rab1A基因表达对NSCLC细胞迁移速率的影响;应用免疫印迹观察干扰Rab1A基因表达对JAK1(Janus Kinase 1)磷酸化水平的影响。结果:与阴性对照组相比,Rab1A siRNA转染组NSCLC细胞系的Rab1A蛋白表达水平显著下调(P<0.01);干扰Rab1A基因表达抑制NSCLC细胞迁移(P<0.01);干扰Rab1A基因表达可下调NSCLC细胞迁移相关蛋白JAK1磷酸化水平(P<0.01)。结论:Rab1A通过调节JAK1磷酸化水平影响NSCLC细胞迁移。

骨桥蛋白与肺癌

骨桥蛋白(OPN)是一种磷酸化糖蛋白,是骨骼和牙齿矿化细胞外基质的主要组成成分.它不仅参与骨的吸收与形成,而且与肿瘤的浸润、转移密切相关,甚至有人认为,它既是肿瘤诊断的标志物,又可作为监测肿瘤预后的指标.对骨桥蛋白与肺癌的浸润、转移及预后的关联予以综述.

JAK2／STAT3信号通路对非小细胞肺癌血管生成的影响

目的探讨两面神激酶2／信号转导及转录活化因子3（JAK2／STAT3）信号通路与非小细胞肺癌（NSCLC）微血管形成之间的关系，以及干预JAK2／STAT3信号通路对血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表达的影响。方法应用免疫组织化学方法检测68例NSCLC和27例正常肺组织中P—JAK2、P—STAT3的表达及微血管密度（MVD）值，并分析与各临床、病理参数的关系；使用不同浓度的JAK2抑制剂AG490处理人肺腺癌细胞A549后，M1Tr法检测细胞的增殖状态，Westernblot法检测JAK2／STAT3信号通路的活化状态，RT—PCR法检测AG490对VEGF、bFGF mRNA的表达的影响；在A549细胞中转染STAT3小干扰RNA（siRNA），Westernblot法检测STAT3及磷酸化-STAT3（P—STAT3）蛋白的表达，RT—PCR法检测VEGF、bFGF mRNA的表达。结果NSCLC的免疫组化结果显示JAK2／STAT3信号通路的活化与MVD计数正相关（P〈0．05）；使用AG490和STAT3 siRNA干预该通路的活化后，VEGF和bFGF mRNA的表达下降（P〈0．05）。结论JAK2／STAT3信号转导通路与肺癌微血管生成密切相关，阻断该通路的活化能抑制血管生成相关因子的表达，提示JAK2／STAT3信号通路是抑制肺癌微血管生成的重要靶点。

分子靶向药物联合多西他赛和泼尼松治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的Meta分析

目的：系统评价分子靶向药物联合多西他赛和泼尼松治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的疗效与安全性。方法：计算机检索Embase、Cochrane Library、PubMed、中国知网、万方数据库、维普中文科技期刊数据库和中国生物医学文献数据库,按照文献纳入标准和排除标准选择应用分子靶向药物联合多西他赛和泼尼松治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的相关文献,评价文献质量并提取资料后,应用STATA 12.0软件进行Meta分析。其中,试验组采用分子靶向药物联合多西他赛和泼尼松治疗方案,对照组采用多西他赛联合泼尼松方案治疗。观察终点包括总生存（overall survival,OS）时间、无进展生存（progressionfree survival,PFS）时间、客观缓解率（objective response rate,ORR）、血清前列腺特异性抗原（prostate-specifi c antigen,PSA）水平、3~4级不良反应和致死性不良事件。结果：共纳入5项临床随机对照试验,总样本量为5 886例。Meta分析结果显示,分子靶向药物联合多西他赛和泼尼松组与多西他赛联合泼尼松组相比,中位PFS时间明显延长[风险比为0.93,95%可信区间（confi dence interval,CI）为0.87~0.99,P=0.018],而OS时间[风险比为0.98,95%CI为0.91~1.04,P=0.441]、ORR（比值比为1.317,95%CI为0.94~1.84,P=0.106）和PSA水平（比值比为1.073,95%CI为0.82~1.40,P=0.604）的差异均无统计学意义。在不良反应方面,试验组可使3~4级不良反应（相对危险度为1.187,95%CI为0.99~1.42,P=0.062）和致死性不良事件（相对危险度为1.298,95%CI为1.02~2.22,P=0.039）的发生率增高。结论：分子靶向药物联合多西他赛和泼尼松治疗转移性去势抵抗性前列腺癌可以延长患者的PFS时间,但是分子靶向药物可增加不良反应的发生率,在临床应用时必须加强预防和对症治疗。

合并病理性骨折对肢体骨肉瘤患者预后影响的Meta分析

目的 ：系统评价合并病理性骨折对肢体骨肉瘤患者预后的影响。方法 ：检索EMBASE、Cochrane Library、Pub Med、中国知网、万方数据库、维普数据库和中国生物医学文献数据库。纳入比较肢体骨肉瘤合并病理性骨折与未合并病理性骨折患者临床疗效的相关文献,应用NewcastleOttawa量表评价文献质量,并提取资料。应用Stata 12.0软件进行Meta分析。结果 ：共10项研究符合纳入标准,总样本量为2 604例,其中合并病理性骨折356例（研究组）,未合并病理性骨折2 248例（对照组）。Meta分析结果显示,研究组患者的3年总生存率[比值比为2.57,95%可信区间（coni dence interval,CI）：1.54～4.29;P=0.000]和5年总生存率（比值比为1.57,95%CI：1.05～2.34;P=0.029）均低于对照组患者。研究组患者的3年无事件生存率（比值比为1.87,95%CI：1.21～2.87;P=0.005）和5年无事件生存率（比值比为1.52,95%CI：1.16～1.99;P=0.002）也均低于对照组患者。两组患者的局部复发风险差异无统计学意义（P〉0.05）。在合并病理性骨折组中,截肢术与保肢术的局部复发风险差异也无统计学意义（P〉0.05）。结论 ：肢体骨肉瘤合并病理性骨折患者的预后较未合并病理性骨折患者的差。保肢术并未明显增加合并病理性骨折的肢体骨肉瘤患者的局部复发风险。