HLA分子重构法检测多肽与HLA-B*1301的结合力

目的:建立弱酸处理后细胞表面HLA分子重构法检测多肽与HLA-B*1301的结合力,并评估其实用性。方法:采用不同pH的柠檬酸缓冲液处理高表达HLA-B*1301的C1R细胞不同时间,中和pH后用含β2m蛋白、布雷非德菌素A的培养液重悬细胞,加入多肽(多肽组)或不加多肽(空白对照)37℃孵育,加入抗HLA抗体后采用流式细胞术检测,以多肽组与空白对照组荧光强度的比值作为衡量HLA分子重构水平强弱的指标,进而代表多肽与HLA-B*1301分子的结合力。结果:pH3.0的缓冲液处理1 min的条件下,HLA-多肽复合物变性解离,细胞表面只保留HLA重链分子,添加具有结合力的多肽可显著提升HLA分子重构水平,可以此评价多肽与HLA-B*1301的结合力。结论:HLA分子重构法检测多肽与HLA-B*1301的结合力操作简便,结果可靠,也可为研究其他低频HLA分子抗原递呈模式提供参考。

组织蛋白酶L激活PKC信号加重TCE致敏小鼠肾脏损害

目的探讨组织蛋白酶L(CTSL)介导三氯乙烯(TCE)致敏小鼠肾脏损伤的分子机制。方法41只雌性BALB/c小鼠随机分为空白组(5只)和溶剂组(5只),TCE处理组(15只)和TCE+CTSLi处理组(16只),建立TCE经皮致敏小鼠模型,对TCE+CTSLi处理组小鼠腹腔注射CTSL抑制剂(10 mg/kg)进行预处理,根据小鼠皮肤致敏评分评估为阳性组和阴性组。通过电镜和HE染色观察小鼠肾脏病理情况,血清尿素氮(BUN)评估小鼠肾功能水平,免疫荧光检测CTSL的表达情况,TUNEL染色评估小鼠肾脏细胞凋亡情况,免疫印迹法检测肾脏蛋白激酶C(PKC)信号分子的活化情况。结果TCE处理组和TCE+CTSLi处理组的致敏率分别为53.3%(8/15)和50.0%(8/16),致敏率差异无统计学差异(P>0.05)。病理学结果表明TCE致敏阳性小鼠出现肾小管细胞水肿、空泡变性,肾小球基底膜增厚,足细胞足突融合,线粒体空泡样变性等表现。肾功能结果表明TCE致敏阳性小鼠血清BUN水平较其他组升高。免疫荧光结果表明CTSL在TCE致敏阳性小鼠肾脏表达水平升高(P<0.05,F=82.438),肾脏结构细胞凋亡水平同样高于其他各组(P<0.05)。免疫印迹结果表明TCE致敏阳性小鼠肾脏中PKC蛋白磷酸化水平升高,而使用CTSLi预处理后,TCE+CTSLi致敏阳性组中的表达出现下调(P<0.05,F=35.686),肾脏细胞凋亡水平降低,肾脏损害得以改善。结论CTSL可能通过激活PKC信号介导肾脏细胞凋亡,加重TCE致敏小鼠肾脏损害。

职业性三氯乙烯药疹样皮炎的免疫机制研究进展

职业性三氯乙烯药疹样皮炎(OMLDT)是一种由于职业接触三氯乙烯引起全身皮肤疾患,伴多系统、器官损伤的免疫性疾病。本文从T细胞免疫、体液免疫和补体系统等方面对OMLDT免疫机制研究进展进行综述,为OMLDT的诊治提供理论依据。

经口暴露三氯乙烯对小鼠肝脏JMJD3表达和M1型库普弗细胞极化的影响

[背景]三氯乙烯(TCE)可通过受污染的水或空气经生物蓄积作用进入人体,从而产生健康危害,受累脏器以肝脏最为多见。[目的]观察TCE经口暴露小鼠肝脏中M1型库普弗细胞(KCs)极化的情况,探讨组蛋白赖氨酸去甲基化酶JMJD3与KCs M1型极化之间的关系。[方法]选取72只SPF级雌性BALB/c小鼠,6~8周龄,将其随机分为4组:空白对照组(18只)、溶剂对照组(18只)、2.5 mg·mL^(-1)TCE组(18只)和5.0 mg·mL^(-1)TCE组(18只),适应性喂养1周。按照课题组前期研究建立小鼠TCE经口暴露模型,染毒8周。分别在第2、4、8周时处死小鼠取肝脏组织,采用Western blotting法检测小鼠肝脏组织中组蛋白赖氨酸去甲基化酶JMJD3的蛋白表达水平,采用免疫荧光法对巨噬细胞标志F4/80和M1型巨噬细胞表面标志CD11c进行共定位,采用免疫组织化学法检测巨噬细胞M1型标志CD16/32和小鼠肝脏M1型巨噬细胞相关炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达情况。[结果]在第2、4、8周时,各组小鼠状态良好,没有出现因TCE染毒而死亡的个体,各组间小鼠耗水量差异无统计学意义,各时间点小鼠体重增长及肝脏系数的组间差异没有统计学意义(P>0.05)。Western blotting法检测结果显示:在各时间点空白对照组和溶剂对照组JMJD3蛋白表达水平差异均无统计学意义,2.5 mg·mL^(-1)TCE组和5.0 mg·mL^(-1)TCE组JMJD3蛋白表达水平相较于对照组均升高,且第4、8周5.0 mg·mL^(-1)TCE组JMJD3蛋白表达水平高于2.5 mg·mL^(-1)TCE组(P<0.05)。免疫荧光共定位结果显示:在各时间点空白对照组和溶剂对照组F4/80与CD11c表达较少,2.5 mg·mL^(-1)TCE组和5.0 mg·mL^(-1)TCE组F4/80与CD11c表达较高。免疫组织化学检测结果显示:CD16/32和TNF-α在空白对照组和溶剂对照组表达较低,而在2.5 mg·mL^(-1)TCE组和5.0 mg·mL^(-1)TCE组出现大量沉积。[结论]KCs M1型极化及促炎因子的表达可能与经口暴露TCE所致的JMJD3表达水平增加有关。

ROS/TXNIP/NLRP3通路在三氯乙烯致敏小鼠皮肤损伤中的作用

目的探讨活性氧/硫氧还蛋白相互作用蛋白/核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(ROS/TXNIP/NLRP3)通路在三氯乙烯(TCE)致敏小鼠皮肤损伤中的作用机制。方法于2020年8月,将40只雌性BALB/c小鼠随机分为空白对照组(5只)、溶剂对照组(5只)、TCE处理组(15只)、TCE+(2-(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基4-亚胺)-2-氧乙基)三苯基氯化磷(Mito TEMPO)联合处理组(15只),建立TCE致敏小鼠模型。在末次激发后24 h根据小鼠背部皮肤红斑和水肿情况将TCE处理组和TCE+Mito TEMPO联合处理组小鼠分别分为致敏阳性组和致敏阴性组。末次激发后72 h处死小鼠,取小鼠背部皮肤,观察小鼠皮肤损伤情况,免疫组织化学法检测小鼠背部皮肤组织NLRP3的表达情况,Western Blot检测小鼠背部皮肤NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase 1)、白介素1β(IL-1β)和TXNIP的相对表达情况,并检测背部皮肤组织细胞内ROS水平。结果TCE组和TCE+Mito TEMPO组小鼠致敏率分别为40.0%(6/15)和33.3%(5/15),两组间差异无统计学意义(P>0.05)。TCE致敏阳性组小鼠背部皮肤表皮明显增厚且有大量炎性细胞浸润,表皮细胞内线粒体数量明显减少,线粒体嵴消失并出现空泡变性;TCE+Mito TEMPO组损伤较之减轻,线粒体数量较多,细胞结构相对正常。TCE致敏阳性组和TCE+Mito TEMPO致敏阳性组小鼠皮肤NLRP3、ASC、Caspase 1、IL-1β和TXNIP蛋白相对表达水平以及ROS含量明显高于溶剂对照组和相应致敏阴性组(P<0.05);TCE+Mito TEMPO致敏阳性组NLRP3、ASC、Caspase 1、IL-1β和TXNIP蛋白相对表达水平以及ROS含量明显低于TCE致敏阳性组(P<0.05)。结论在TCE所致药疹样皮炎中,ROS/TXNIP/NLRP3通路激活促进IL-1β的释放,加重皮肤损伤。