14型副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其致病性检测

为探究河南省某大型养猪场育肥猪发生疫情的原因,本研究从该猪场采集的病料样品中进行细菌分离,并对分离菌经革兰氏染色及电镜观察其形态、16S rRNA PCR鉴定;采用多重PCR鉴定其血清型并将扩增的funAB基因与GenBank中的其它副猪嗜血杆菌(HPS)参考株的相应基因进行同源性分析并构建该基因的进化树;采用纸片扩散法鉴定分离菌株的药敏特性并利用小鼠进行了其致病性试验。结果显示:经形态观察、培养特性鉴定以及16S rRNA的PCR鉴定,该分离菌为HPS;经多重PCR并经测序鉴定分离菌为14型HPS,将其命名为JZ-2019;funAB基因的同源性分析及进化树结果显示,JZ-2019株与14型HPS IA-84-22113株(KC795520.1)的同源性为100%。药敏试验结果显示,分离菌对β-内酰胺类、大环内酯类以及氨基糖苷类药物敏感,其中对大环内酯类药物最为敏感;小鼠致病性试验结果显示,小鼠均出现临床症状,甚至死亡,且小鼠各脏器组织均出现不同程度的出血等剖检症状;经PCR扩增从死亡小鼠的脑、腹水中扩增出与分离菌株一致的细菌。表明,该分离菌对小鼠有较强的致病性,且能通过小鼠血脑屏障。本研究证明了河南省猪群中存在14型HPS的感染,为中原地区防控HPS病提供了参考依据。

猪流行性腹泻病毒jiaozuo1012/2019株的分离鉴定及遗传进化分析

为确定2019年河南焦作某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因,本研究采用RT-PCR方法对该发病猪场送检的5份仔猪肠内容物样品进行仔猪腹泻相关病毒检测,对检测的猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性样品进行病毒分离,对分离的PEDV S基因和ORF3基因进行PCR扩增,并分析这两个基因与GenBank中的PEDV参考株相应基因的同源性及遗传进化分析。结果显示,送检的5份猪肠道内容物样品PEDV检测结果均为阳性,而猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)的检测结果均为阴性;将随机选取的1份PEDV阳性样品接种Vero细胞并经传代培养,对培养5代的病毒经PCR检测表明分离到一株PEDV,并将其命名为jiaozuo1012/2019株;基于S基因同源性分析结果显示,该分离株与河南分离的PEDV CH/HNLH/2015株同源性最高,为99.3%,与近期河南分离株的同源性为96.4%~99.0%,与经典PEDV CV777株的同源性较低为93.4%。分离株S基因编码的氨基酸在aa59~aa62位存在4个氨基酸(59QGVN62)的插入,在aa140和aa163~aa164分别存在1个和2个氨基酸的缺失(140N和163NI164);ORF3基因的同源性分析结果显示,分离的PEDV与江苏分离的PEDV JSCZ1601株的同源性最高,为99.7%,与近年来河南分离株的同源性为98.5%~99.6%,与经典株CV777的同源性较低为96.6%;S基因与ORF3基因的进化树结果显示,该分离株与目前国内流行株遗传关系最近。上述结果表明,本研究分离的PEDV具有近年来新流行PEDV株的序列特征,与经典PEDV株具有相对较远的遗传进化关系。本研究为进一步探究PEDV在河南地区的变异规律提供了参考依据。

利用CHD基因鉴定鸽子性别的研究

为了能够快速并准确地鉴定鸽子性别,试验利用CHD基因鉴定引物,通过PCR技术对鸽子CHD基因进行特异性扩增,经琼脂糖凝胶电泳,分别从待检鸽子PCR产物中检测到2条带和1条带,并对待检鸽子性别进行解剖印证,结果显示,2条带为雌鸽,1条带为雄鸽;对获取的雌、雄鸽子PCR产物回收纯化后,与pMD19-T载体连接并转入K12感受态细胞,挑取阳性克隆进行测序分析,发现所检序列确为CHD-Z、CHD-W基因;此外,在优化退火温度时发现,雌性鸽子扩增序列600 bp处,扩增效果易受退火温度影响,且与雄鸽该处的扩增效果存在差异,利用雌雄鸽子PCR扩增效率的不同也能达到鉴别鸽子性别的目的。结果表明:本研究验证了利用CHD基因来鉴别鸽子雌雄的方法,其准确率为100%。发现CHD基因特定位点的PCR扩增效率受性别影响,由此发展出基于PCR扩增效率的性别鉴定方法。本研究为鸽子的性别早期鉴定和准确鉴定提供了参考。