甜瓜属异源多倍体不同倍性材料内参基因的筛选及评估

[目的]多倍化是植物界普遍存在的现象,但是内参基因的缺乏限制了多倍化相关基因表达研究的进程。本文旨在建立一组稳定的内参基因,以提高多倍体目标基因定量的准确性和重复性。[方法]以甜瓜属人工异源四倍体、其二倍体双亲和三倍体后代为材料,通过实时荧光定量反应(qPCR)比较了10个候选内参基因(UBI-ep、ACT、ACT3、TUA、EF-1α、CACS、TIP41、F-box、CYP和UBQ)的表达丰度,并利用geNorm和NormFinder软件对其表达稳定性进行分析。同时,通过转录组测序(RNA-seq)的方法对候选内参基因进行定量,并统计与荧光定量数据的相关性。[结果]荧光定量结果表明,二倍体黄瓜的CYP表达丰度最高,CT值为15.8;四倍体材料的F-box表达量最低,CT值为30.5。结合geNorm和NormFinder软件结果,一共筛选出4个稳定的参考基因F-box、TIP41、ACT3和ACT。其中F-box和TIP41在多倍性水平下稳定性值M比ACT3和ACT基因的小,但表达丰度低。以ACT3为内参时,qPCR与RNA-seq定量结果极显著相关(R^(2)=0.844,P<0.01),F-box为内参时相关性最小。[结论]当比较不同倍性水平或跨物种的转录本丰度时,需要注意内参基因的选择。针对甜瓜属多种倍性材料的低丰度表达基因,可以选择TIP41作为内参基因;对于高表达基因,可采用ACT3作为内参基因。

甜瓜果形基因CmSUN25-26-27a的鉴定和分子标记

【目的】挖掘甜瓜果形相关基因,为甜瓜果实形状的遗传改良提供理论基础。【方法】通过全基因组鉴定,系统发育分析,结合表达量与果形的关联分析来鉴定参与甜瓜果形调控的CmSUN基因,并利用候选基因在自然群体中的序列变异开发相关分子标记。【结果】通过全基因组鉴定及系统发育分析,鉴定到甜瓜CmSUN家族的CmSUN25-26-27a基因。该基因在开花当天的雌花中有显著的表达,并且在不同果形甜瓜中的表达量与果形指数(fruit shape index,FSI)呈正相关关系;对200份自然群体的序列分析发现,CmSUN25-26-27a基因编码区存在一个SNP-Single Nucleotide Polymorphism(A/G),导致了编码氨基酸的非同义突变,含有CmSUN25-26-27a^(A)等位基因的厚皮甜瓜的FSI显著高于含CmSUN25-26-27a^(G)等位基因的厚皮种质。该SNP位点将厚皮甜瓜按果形大致分为FSI>1.5(A)和FSI<1.5(G)两种类型。根据该SNP位点设计了用于区分甜瓜果形的dCAPS标记。【结论】CmSUN25-26-27a同源基因广泛参与葫芦科作物的果形调控,该基因在甜瓜中的表达量及序列变异与甜瓜FSI具有显著相关性。

甜瓜叶绿素含量全基因组关联分析及候选基因预测

【目的】挖掘与叶绿素含量显著关联的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点和候选基因,为甜瓜叶绿素含量改良提供分子靶点和基因资源。【方法】以118份具有广泛变异的甜瓜种质为自然群体,采用2 531 449个高质量SNP标记对叶片叶绿素含量进行全基因组关联分析,挖掘优异等位变异,并预测候选基因。【结果】甜瓜自然群体叶绿素含量趋向正态分布,包含5个明显的亚群。利用Q模型对2次试验的叶绿素含量及其最佳线性无偏预测(best linear unbiased prediction,BLUP)值进行关联分析,共检测到15个显著位点,分布在甜瓜第1、2、4、8、11、12号染色体上,表型贡献解释率为5.62%~6.69%。其中,8个位点的不同基因型之间存在显著表型差异。结合关联位点的候选区域和转录组数据,共鉴定到28个差异表达基因,其中MELO3C018513.2和MELO3C003666.2是改良甜瓜叶绿素含量的潜在候选基因。【结论】通过高质量SNP标记Q模型的全基因组关联分析,共检测到15个与叶绿素含量显著关联的位点,筛选出2个可能与叶绿素含量相关的重要基因,为甜瓜叶绿素含量的遗传改良提供了基因资源。

甜瓜HD-Zip家族基因的鉴定及在表皮毛发育中的表达分析

【目的】研究HD-Zip家族基因在甜瓜表皮毛发育过程中的表达模式和功能。【方法】利用生物信息学方法对甜瓜HD-Zip家族基因进行全基因组鉴定、染色体定位、系统进化分析、基因结构分析、理化性质分析、保守序列分析、顺式作用元件预测、共线性分析、蛋白互作网络预测和调控该家族基因的MicroRNA预测,并结合甜瓜不同组织部位和不同表皮毛材料的转录组分析及qRT-PCR验证,筛选与甜瓜表皮毛发育相关的基因。【结果】甜瓜基因组编码37个HD-Zip家族成员,不均等地分布在9条染色体上。该家族成员分为4个亚家族,各亚家族成员具有相似的基因结构和保守基序。共线性分析显示,甜瓜HD-Zip家族基因的形成存在着连锁遗传且伴随串联复制、片段复制等染色体复制事件的发生,其基因组进化过程与黄瓜高度相似。顺式元件分析显示,该家族成员含有与表皮毛发育相关的赤霉素、茉莉酸、脱落酸和水杨酸响应元件。调控HD-Zip家族基因的MicroRNA主要有miRNA166、miRNA17和miRNA395家族。不同表皮毛甜瓜材料的转录组分析显示,该家族中CmHDZ1、CmHDZ3、CmHDZ14、CmHDZ17和CmHDZ36基因在无表皮毛材料中表达显著下调,CmHDZ21、CmHDZ23和CmHDZ28基因表达显著上调。进一步在不同表皮毛材料的子房和叶片中的表达模式分析显示,与有表皮毛材料相比,CmHDZ5、CmHDZ14、CmHDZ17基因在无表皮毛材料中表达显著下调,CmHDZ22基因表达显著上调。【结论】甜瓜中编码37个HD-Zip家族基因,基于其在甜瓜不同组织部位和不同表皮毛材料中的表达模式分析,筛选到9个与甜瓜表皮毛发育密切相关的CmHDZs基因,其中CmHDZ1、CmHDZ14、CmHDZ17基因在无表皮毛甜瓜中的表达显著下调,可能参与赤霉素和茉莉酸途径介导的甜瓜表皮毛发育的正调控,CmHDZ22基因在无表皮毛甜瓜中表达显著上调,可能负调控表皮毛的发育。

甜瓜幼苗耐冷性相关生理指标的综合评价

【目的】明确10个生理指标与甜瓜幼苗耐冷性的关系。【方法】以26份耐冷性差异明显的甜瓜种质为试材,分别测定在低温处理后各种质幼苗的电导率、丙二醛含量、叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游离脯氨酸含量、根系活力、POD活性、SOD活性、CAT活性等10个低温逆境相关的生理指标,采用基本统计量比较、灰色关联分析、相关分析、主成分分析等方法对耐冷性进行综合评价。【结果】在室内4℃低温处理48 h后种质间冷害指数差异最大,且达到极显著水平,不同种质之间各生理指标差异显著。其中丙二醛、游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿素含量及电导率与耐冷性密切相关,具有较高的关联度和相关系数,且在主成分分析中对耐冷性的贡献率较大。基于这6个生理指标数据,聚类分析能将耐冷性不同的种质区别开。【结论】10个生理指标可简化为6个指标,即丙二醛、游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿素含量及电导率,其中游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量可优先作为甜瓜耐冷性的评价指标,用于甜瓜耐冷性育种研究。

基于多序列比对的甜瓜SSR标记开发及应用

采用多序列比对的方法,从甜瓜EST序列中发现约1 100个SSR差异位点,并随机挑选50个位点设计成SSR引物,对47份遗传背景不同的甜瓜种质进行PCR扩增。结果表明,41对引物可产生清晰的带谱,有效扩增率达82.00%,且均具有多态性。共检测到130个等位基因,平均3.17个。Na、Ne、Ho、He、PIC等参数表明,这些标记具有一定程度的多态性。本研究开发的SSR标记可用于甜瓜的遗传多样性和群体结构分析,基于多序列比对的标记开发方法亦可在基因组信息丰富的物种中应用。

薄皮甜瓜新品种菊城622的选育

菊城622是以自育多代自交系纯合材料KT128为母本、KT150为父本杂交选育而成的薄皮甜瓜新品种。该品种在河南省春季塑料大棚栽培全生育期90 d,果实发育期28 d。植株长势强,直立性好,节间短,连续坐果能力强,每株可留瓜3~5个。果实棒状,果皮灰白色,果肉绿色,口感酥脆爽口,清香味,果实整齐一致。平均单瓜质量0.5 kg,平均果肉厚度2.1 cm,中心可溶性固形物含量(w,后同)14.7%,边部12.3%,667 m^(2)产量约3200 kg。适合在黄淮生态区河南省及周边地区栽培。该品种于2022年6月通过农业农村部非主要农作物品种登记。

河南省主栽甜瓜品种苗期表型性状变异分析

以河南省内收集的30份主栽甜瓜品种为试材,分析了其苗期16个表型性状的变异。结果表明：苗期表型性状变异较大,数量性状的变异系数介于14.24%~62.96%,其中子叶面积的变异系数最大;质量性状的变异系数介于10.80%~60.49%,真叶形状变异系数最大。主成分分析表明,16个性状指标可转化为5个独立的综合指标,其累计贡献率达82.40%。聚类分析表明,30份甜瓜品种可划分为5类,各类之间性状差异较大。上述结果明确了河南省主栽甜瓜品种苗期性状的变异,为基于苗期性状的优异品种筛选及培育提供理论依据。

十五份甜瓜种质苗期性状的聚类分析及相关分析

以15份有代表性的甜瓜种质为试材，统计分析了其苗期13个质量性状和数量性状的变异和相关，以期为杂交育种亲本的选配以及苗期性状预测提供理论依据。结果表明：苗期性状变异丰富，数量性状的变异系数在35．32％和112．34％之间，其中真叶面积的变异系数最大，下胚轴长变异系数最小；质量性状的变异系数变幅为27．189／6～49．699／6，子叶形状变异系数最小，子叶颜色变异系数最大；聚类分析结果表明，0869（“Tyeha”）和0969（“P1—164852”）聚为一类，其遗传背景与其它种质相差较大；在欧式距离为5．52处，可划分为厚皮类群和薄皮类群；相关分析表明，13种苗期性状中，子叶宽与单果鲜重呈显著正相关，相关系数达到0．619，可用于对甜瓜产量性状进行预测。

甜瓜果实性状EST-SSR位点及优异等位变异分析

为发掘甜瓜果实上重要性状的QTL、优异等位变异及其携带优异等位基因的载体材料。利用一般线性模型对192份甜瓜种质的果实表型和41个SSR标记基因型进行关联分析,通过无效等位基因统计相关位点等位变异的表型效应。结果获得显著关联位点12个,其等位变异中,HNM15-158、HNM26-260、HNM45-210和HNM24-143分别是果实单重、可溶性固形物、果实纵径和果实肉厚的增效效应最大的等位基因,对应典型载体材料分别为PI-143215(1)、PI-136192、PI-313970和PI-145594。发掘甜瓜果实性状关联位点优异等位变异不仅可以为甜瓜分子标记辅助育种提供标记信息,还可以促进后续功能基因研究的发展。

黄瓜microRNA171的克隆与功能分析

为了解microRNA171(miR171)对黄瓜的调控作用,从华北型黄瓜‘北京截头’中克隆了Csa-miR171家族的4个miRNA前体序列Csa-miR171a、Csa-miR171b、Csa-miR171c、Csa-miR171d,对前体序列进行比对与进化分析,预测成熟序列的靶基因并进一步开展了拟南芥遗传转化功能研究。结果表明,4个前体共剪切出两种成熟序列Csa-miR171a和Csa-miR171b,系统进化显示,Csa-miR171a、Csa-miR171b、Csa-miR171c、Csa-miR171d分别与甜瓜Cme-miR171e、Cme-miR171c、Cme-miR171a、Cme-miR171b同源性最近,与拟南芥、水稻、番茄等较远;Csa-miR171a、Csa-miR171b成熟序列主要靶向GRAS转录因子蛋白家族基因,拟南芥中过表达Csa-miR171a前体改变了叶片形态、颜色、抽薹时间、根、果实、花器官形态等多个表型性状。

哈氏黄瓜NAC转录因子的鉴定及低温表达分析

以哈氏黄瓜(Cucumis sativus var. hardwickii)为试验材料,基于全基因组测序结果,利用生物信息学分析方法,鉴定获得77个NAC转录因子,其结构高度保守,序列长度在151~653个氨基酸之间,在7条染色体中呈非均匀分布;理论等电点在4.54~9.10之间;大部分转录因子定位在细胞核和细胞质膜上;系统发生分析显示所有NAC转录因子聚类为6个亚家族,其中亚家族Ⅲ序列结构较为多样性;进化分析发现NAC转录因子存在片段重复和串联重复等复制模式,没有发生近代的全基因组复制事件,并在进化过程中受到纯化选择作用;NAC转录因子基因在哈氏黄瓜幼苗根中表达量最高,其次为雌花和叶片;荧光定量分析发现,低温处理下,检测的15个NAC基因中有12个显著上调表达,3个下调表达,并存在一组表达量差异明显的HdNAC32–Hd ANC47片段复制基因对。由此可知NAC转录因子在受低温胁迫的哈氏黄瓜中发挥重要的转录调控作用。