重组牛IFN-γ蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达、纯化和鉴定

为合成与天然构象相似的干扰素γ蛋白,通过优化干扰素序列的密码子序列,利用杆状病毒表达系统合成真核重组牛IFN-γ蛋白。实验化学合成牛IFN-γ基因,并将该基因克隆至真核表达载体pFastBacHTA中,将构建成功的重组载体与DH10Bac感受态大肠杆菌进行转座形成穿梭载体,穿梭载体质粒瞬时转染至SF9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒,最后利用SF9昆虫细胞悬浮培养大量表达目的蛋白。蛋白纯化后经Western Blotting和BOVIGAM牛分枝杆菌IFN-γELISA检测试剂盒检测分析,具有较好的免疫原性和反应原性。研究结果为牛IFN-γ的单克隆抗体制备以及牛结核病临床诊断奠定了基础。

我国种猪主要垂直传播性疫病流行态势分析及控制策略探讨

种源疫病控制是生猪疫病防控工作的基础。本文以全国重点原种猪场监测数据、生猪屠宰场监测数据为基础,结合相关分子流行病学调查结果,系统分析了我国种猪主要垂直传播性疫病的流行态势、主要原因和控制策略,以期为我国进一步完善种猪疫病控制提供依据。

动物疫病防控净化新型监测模式——现场快速诊断检测与远程监测云平台的构建与应用

当前,我国动物疫病防控领域实验室存在现场实时快速诊断技术落后、检测工作滞后、疫病监测数据不能实时共享分析、重大动物疫病预警不及时、应急处置协调复杂困难等问题。探索建立重大动物疫病远程实时监测预警大数据云平台等新型监测模式是当前动物疫病防控信息化的当务之急。本文介绍了目前动物疫病防控净化的新型监测模式——现场快速诊断检测与远程监测云平台的构建与实际应用情况。上述平台的构建与应用,在创新推动我国重大动物疫病净化工作的同时,重点解决了当前动物疫病防控净化过程中传统实验室检测效率较低、检测数据不能够互联互通等问题,为创新我国动物疫病防控净化新型监测模式提供了借鉴,同时也为我国动物疫病防控净化提供了强而有力的技术支撑。

A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法的建立

为建立动物血清中的A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,通过获得的A型口蹄疫病毒VP1融合蛋白与相关单克隆抗体建立了A型口蹄疫病毒抗体竞争化学发光检测试剂盒。该方法能够特异性的定量检测猪、牛、羊血清中的A型口蹄疫病毒VP1蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的偶蹄类动物病原无交叉反应,批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,具有良好的重复性。对该方法的特异性指标和敏感性指标进行了验证,同国产的A型口蹄疫抗体检测试剂盒进行了比较,阳性样品符合率为92.63%,阴性样品符合率为93.98%,总符合率为93.17%。建立的A型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,特异性高,敏感性强,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。

O型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法的建立

为建立动物血清中O型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法,通过获得的O型口蹄疫病毒VP1融合蛋白与相关单克隆抗体,制备了O型口蹄疫病毒抗体竞争化学发光检测试剂盒。结果表明:该方法能够定量检测猪、牛、羊血清中的O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗体,与其他偶蹄类动物病原无交叉反应,具有良好的重复性;对该方法的特异性指标、敏感性指标进行了验证,同国产O型口蹄疫抗体检测试剂盒进行了比较,阳性样品符合率92.62%,阴性样品符合率92.14%,总符合率92.45%;重复性试验组内与组间变异系数分别低于10%和15%。综上,该研究建立的O型口蹄疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法特异性高、敏感性强,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。

禽白血病病毒抗原高敏荧光微球快速定量检测方法的建立

为建立快速定量检测家禽样本中禽白血病病毒抗原的方法,对禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体细胞株2E5和3D5进行复苏、鉴定,通过反应条件优化,建立了禽白血病病毒抗原高敏荧光微球快速检测方法。该方法能够快速定量检测家禽样本中禽白血病病毒,敏感性高、特异性强,对其他家禽病原无交叉反应且具有良好的检测重复性。对采自全国的240份临床家禽样品进行检测,同时用美国IDEXX公司生产的ELISA抗原试剂盒开展比较,结果发现两种方法符合率达93.98%,其中阳性样品符合率为90.83%,阴性样品符合率为95.83%;组内与组间变异系数分别低于10%和15%。本研究建立的禽白血病病毒p27抗原高敏荧光微球快速检测方法,特异性高、敏感性强,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。

我国27个省份牛恶性卡他热病毒抗体的血清学检测

为摸清我国牛恶性卡他热(BMCF)的流行情况,用间接ELISA(i-ELISA)方法对采自新疆、青海和甘肃等27个省(市)养殖场、屠宰场和散养户的2731份牛血清进行了抗体检测。同时对选用试剂盒检测质控血清的性能、检测分析敏感性、检测方法的交叉反应等指标进行了验证。结果表明,共检测出阳性牛血清样本29份,阴性牛血清2702份,阳性率1.06%;按不同牛血清来源统计,牛恶性卡他热的规模场阳性率0.56%,散养户阳性率1.18%,屠宰场阳性率1.93%;按不同饲养方式统计,牛全舍饲饲养方式的牛恶性卡他热病毒抗体阳性率0.41%,半舍饲饲养方式的牛恶性卡他热病毒抗体阳性率0.35%,放牧饲养方式的牛恶性卡他热病毒抗体阳性率0.35%。说明我国养殖的牛群中存在牛恶性卡他热的感染,但感染流行率较低,个别省(市)呈散发状态。

原核载体表达的小反刍兽疫病毒N蛋白的保存期与相关抗原性、特异性研究

为明确使用原核表达载体pET-32a表达纯化的小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白(N)的最佳保存期,检测其相关抗原性与特异性,通过优化N抗原序列的密码子和蛋白表达纯化条件,在大肠杆菌表达系统中成功获得了3批次高效表达的小反刍兽疫病毒可溶性重组N蛋白。将3批次小反刍兽疫病毒N蛋白放置2~8℃保存,分别于1、2、3、6、9、12、15个月检验蛋白性状、蛋白浓度、纯度、抗原性和特异性等指标。经分析,各个时期蛋白的抗原浓度、抗原性、特异性等要素均符合标准,N蛋白保存15个月后,依然具有较强的检测抗原性与特异性。该研究结果为今后以小反刍兽疫N蛋白为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法以及双抗原夹心ELISA抗体检测方法奠定了坚实的基础。

小反刍兽疫病毒N蛋白抗体与H蛋白抗体在羊体内代谢消长规律的研究

为研究小反刍兽疫病毒N蛋白抗体与H蛋白抗体在羊体内的代谢消长规律,试验通过建立小反刍兽疫N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法、H蛋白阻断ELISA抗体检测方法与血清中和抗体试验方法,分别检测了羊免疫疫苗后体内N蛋白抗体与H蛋白抗体在每个免疫阶段的代谢消长变化。结果表明:羊免疫小反刍兽疫疫苗后,血清内的N蛋白抗体与H蛋白抗体在6~8周时血清抗体效价较高,对应的羊体内中和抗体效价为1∶512,且效价至少可以持续到10周以上,2种抗体具有一定消长代谢规律的相关性。该研究结果也为以N抗原与H抗原为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法、竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA检测方法奠定了一定的理论依据。

利用激光捕获和高效液相色谱质谱对石蜡包埋口腔黏膜癌变组织的蛋白组学分析

目的：对口腔黏膜癌变的蛋白组学分析和分子标志物筛选可能为早期诊断、预防和分子治疗提供依据和帮助。方法：对3例石蜡包埋口腔黏膜癌变组织样本,利用激光显微切割技术捕获口腔黏膜癌变上皮和癌旁正常黏膜上皮,抽提组织样本蛋白,利用高效液相色谱-质谱联用进行口腔黏膜癌变组织的蛋白组学分析。结果：激光显微切割-高效液相色谱质谱联用可以分析400~700个多肽序列,鉴定出100~200个蛋白,涉及到细胞骨架、细胞代谢、信号转导、细胞周期等各个方面。结合文献,对其中的角蛋白表达变化进行了分析和验证。结论：显微切割结合高效液相色谱质谱可以实现对石蜡包埋组织的蛋白组学研究,具有较高的重复性和可靠性。角蛋白表达谱的变化验证了该平台的作用和价值,也可作为口腔黏膜癌变的潜在标志物。

牛血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法的建立

为研究快速定量检测牛血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的方法,试验通过优化抗原表达条件等步骤,在大肠杆菌原核表达系统中表达可溶性的3A-3B融合蛋白,并基于纯化的可溶性融合蛋白建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒。结果表明:建立的方法能够检测牛血清中的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的牛类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数分别低于10%和15%,具有良好的重复性。对300份临床牛血清样品进行检测,同Procheck公司的口蹄疫非结构蛋白抗体试剂盒进行比较,阳性样品符合率96%,阴性样品符合率93.3%,总的符合率95.7%。重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。文章首次建立了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法,同传统的ELISA方法相比,该检测方法特异性相当、敏感性更高,操作更简单、快速,具有较高的应用推广价值。

PRRSV GP5和M抗原中和表位的融合表达与纯化以及间接ELISA检测方法的建立

为建立检测猪血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中和抗体的间接ELISA方法,分析了PRRSV结构蛋白GP5和M的二级结构抗原指数、抗原性、亲水性、表面可及性以及潜在中和表位等参数,选取GP5的47~61、143~156和186~199位氨基酸,M蛋白的63~70、133~146和156~169位氨基酸作为免疫原,构建带接头序列的GP5/M中和表位融合表达质粒;通过优化大肠杆菌表达和蛋白纯化条件,免疫印迹鉴定GP5/M特异抗原,获得了可溶性的GP5/M中和表位融合蛋白。基于纯化的GP5/M中和表位融合抗原,建立了检测猪血清中PRRSV中和抗体的间接ELISA方法。采用建立的间接ELISA方法对6种其他猪源病原阳性血清进行检测,结果均无交叉反应;敏感性试验显示,将血清中和试验鉴定的PRRSV阳性对照血清稀释到1:12800时仍呈阳性;重复性试验显示,批内重复变异系数为2%~10%,批间重复变异系数小于15%;符合性试验显示,同时用建立的间接ELISA方法和血清中和试验对420份临床血清样品进行检测,结果符合率为95.24%。结果表明,该方法操作简单、耗时短,敏感性、特异性、重复性及符合性均良好,具有较好的应用推广价值。

一起猪圆环病毒病的诊断和防治

猪圆环病毒是猪场常见的免疫抑制病,感染后常导致疫苗免疫效果差,甚至免疫失败。该病常与其他病毒病混合感染,且感染该病后易继发其他细菌性疾病,使疫病控制变得困难与复杂。近年来,猪圆环病毒病单独致病的病例逐渐增多,症状和病理变化更加典型,具有较高的致死率,应引起足够的重视。(一)发病情况北京房山某猪场,存栏210头.

基于手机遥控的智能插座设计

设计了一种基于手机遥控的智能插座。系统以单片机STC12C5608AD为主控芯片,利用TC35型号GSM短信模块与手机连接,实现远程控制智能插座的开启和断开状态。文章详细描述了智能插座的软硬件构成和工作原理,并给出以TC35模块为通信核心的无线数据传输系统的设计方案。

山青、水秀、人杰的“虎跑”

俗话说：“自古名茶伴名泉，好茶还需好水泡。”中国自古就是个产茶大国，南方的茶尤为最佳，就拿杭州的龙井茶来说吧，香郁，形美，味甘，被誉为“三绝”。倘若你去过杭州，在那里品过龙井，你就会发现，在那里喝龙井比在别处喝更香，这是由于好茶一定要用当地的水泡，尤其是泉水，泡出的茶会更香。而泡龙井的水又以虎跑的泉水最为上乘，素有“饮之舌根尽流芳，香馨数月回九肠”之说。

禽白血病病毒抗原化学发光免疫分析检测方法的建立

为建立家禽样本中的禽白血病病毒抗原化学发光免疫分析检测方法,本研究通过获得的禽白血病病毒P27融合蛋白与相关单克隆抗体建立了家禽样本中的禽白血病病毒抗原化学发光检测试剂盒。该方法能够特异性地定量检测家禽样本中的禽白血病病毒抗原,敏感性高,特异性强,对其他相关的禽类病原无交叉反应。对该方法的特异性指标、敏感性指标进行了验证,同进口的禽白血病病毒抗原ELISA检测试剂盒进行了比较,结果显示,阳性样品符合率为92.63%,阴性样品符合率为93.17%,总符合率为93.98%。重复性试验的组内与组间变异系数均小于10%,具有良好的重复性。上述结果表明,本研究建立的禽白血病病毒抗原化学发光免疫分析检测方法特异性高、敏感性强,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。

口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法的建立

为建立快速定量检测羊血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的方法,本研究通过优化抗原表达条件等步骤,在大肠杆菌原核表达系统中获得了可溶性的3A-3B1-3B2融合蛋白,基于纯化的可溶性融合蛋白建立了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒。该方法能够检测羊血清中的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的羊类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数分别低于10%和15%,具有良好的重复性。对300份临床血清样品进行检测,同Procheck公司的口蹄疫非结构蛋白抗体试剂盒进行比较,阳性样品符合率为98%,阴性样品符合率为92%,总符合率为95%。重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法同传统的ELISA方法相比,特异性相当、敏感性更高,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。

基于不同重组小反刍兽疫病毒N蛋白建立的双抗原S-ELISA抗体检测方法的比较研究

为探索建立小反刍兽疫病毒抗体双抗原夹心ELISA方法的原料,本研究成功使用pET-30a与p ET-32a两个不同原核载体分别表达与纯化了小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白N抗原。使用不同原核载体表达的N抗原组合建立的双抗原夹心ELISA抗体检测方法、相同原核载体表达的N抗原组合建立的双抗原夹心ELISA抗体检测方法、N抗原包被建立的抗体间接ELISA检测方法以及血清中和试验方法分别对已知背景的小反刍兽疫抗体阳性血清与小反刍兽疫抗体阴性血清进行检测。综合考虑方法的敏感性、特异性和稳定性,最终选择用不同原核载体表达的pET-30a-(N)与pET-32a-(N)抗原组合建立的小反刍兽疫病毒抗体双抗原夹心ELISA检测方法。

非洲猪瘟病毒抗原检测试纸条检测方法的建立及初步评价

分别以非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白特异性单克隆抗体3E1株和7A7株作为检测抗体和捕获抗体,建立了ASFV抗原试纸条检测方法。该方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)均无交叉反应;对ASFV P72重组蛋白的最低检测量为2.50μg/L;稳定性试验结果表明,试纸条可在2~8℃条件下保存15个月。对100份临床样品的检测结果显示,该方法与荧光定量PCR的符合率为85%。本研究建立的ASFV抗原检测试纸条特异性强、灵敏度高,可用于临床样品中ASFV抗原的检测。

小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白抗原性与特异性的比较

为筛选建立小反刍兽疫病毒N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法的抗原原料,本研究通过优化大肠杆菌密码子、优化蛋白表达与纯化条件等方法,分别在pET-30a与pET-32a两个不同原核表达载体中成功获得了可溶性的小反刍兽疫核衣壳蛋白(N)。分别对重组大肠埃希氏菌pET-30a-(N)-BL21(DE3)株与pET-32a-(N)-BL21(DE3)株种子批的P7代与P20代进行蛋白诱导表达与抗原提取纯化,共获得6批小反刍兽疫病毒pET-30a-(N)蛋白与pET-32a-(N)蛋白,并对蛋白的浓度、纯度、抗原性和特异性进行检验。结果表明两个纯化后的重组抗原与羊小反刍兽疫病毒阳性血清有明显反应,具有较好的反应性,而与羊痘病毒阳性血清、羊口蹄疫病毒阳性血清、山羊关节炎/脑炎病毒阳性血清等特异性血清均无交叉反应,具有较好的特异性。本研究结果为今后以N蛋白为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法,竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA抗体检测方法打下了坚实的基础。