重组溶瘤2型单纯疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立与验证

目的为了建立高效、敏感的针对重组溶瘤2型单纯疱疹病毒(oHSV2)的荧光定量PCR方法。方法依据oHSV2的基因序列,登录Beacon Designer 8.0软件设计引物,提取前期已重组好的阳性质粒pHG52d34.5CMVhGM-CSF,测定浓度并换算后梯度稀释为荧光定量PCR的模板,进行PCR反应。结果经过多次调整实验的反应条件和反应体系,熔解曲线为单一峰,该病毒与野生型Ⅰ型单纯疱疹病毒、野生型Ⅱ型单纯疱疹病毒等没有交叉反应。oHSV2最低检测限为1000 copies/μL,R^2可达0.997,批内及批间变异系数分别为0.357%~1.156%和1.06%~3.35%,体液(血液)中预加的oHSV2的回收率为96.6%~109.3%。结论成功建立了oHSV2的SYBR Green实时荧光定量PCR方法,可特异而灵敏地检测血浆中的oHSV2。

建立稳定表达荧光素酶的B16R细胞系

目的建立稳定表达荧光素酶的小鼠黑色素瘤细胞系(B16R),并构建适用于小动物活体成像观察的C57小鼠皮下移植瘤模型。方法利用脂质体将携带荧光素酶基因的质粒转染到小鼠黑色素瘤细胞株B16R中,用嘌呤霉素筛选出表达荧光素酶的单克隆细胞株B16R-Firefly luciferase(B16R-FLUC),再用化学发光检测B16R-FLUC荧光素酶基因的表达,扩增培养后,接种于C57小鼠,建立C57小鼠皮下移植瘤模型,通过活体动物成像系统检测B16R-FLUC的成瘤性。结果化学发光方法检测出B16R-FLUC细胞中荧光素酶基因,动物活体成像系统检测出C57皮下移植瘤中荧光信号,B16R-FLUC有很好的成瘤特性。结论成功构建稳定表达荧光素酶的B16R细胞系,为客观性评价抗黑色素瘤新药的治疗效果提供了实验基础。