大熊猫白血病抑制因子RNAi干扰载体的构建及应用

旨在构建大熊猫白血病抑制因子(LIF)RNAi重组质粒,以期进一步研究LIF对大熊猫骨髓间充质干细胞(PDBM-MSCs)的调控作用.试验设计3组大熊猫LIF shRNA慢病毒pLKO.1 puro-LIF-down干扰载体,通过慢病毒的方式感染PDBM-MSCs,经q-PCR鉴定重组质粒pLKO.1 puro-LIF-down-1抑制效果最显著.pLKO.1 puro-LIF-down-1实验组和空质粒对照组比较发现,LIF mRNA表达水平抑制后能够显著下调细胞周期调控基因CDK2、CCNB2、CCND3的mRNA表达水平(P<0.05);显著上调凋亡基因P53、P16、P27、caspase3的mRNA表达水平(P<0.05);显著下调干性基因KLF4、SOX2的mRNA表达水平(P<0.05).以上结果表明,此次研究成功构建出大熊猫LIF RNAi干扰载体,LIF对PDBM-MSCs的生长和干性维持具有重要的调控作用,为大熊猫干细胞的体外培养及干性机制的研究奠定基础.

大熊猫LIF基因的原核表达及其单克隆抗体的制备与鉴定

为获得大熊猫LIF单克隆抗体,将大熊猫LIF基因编码区23~203基因片段添加酶切位点合成后连接到pET30a原核表达载体上,转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达、纯化蛋白后作为免疫原,对BALB/c小鼠进行免疫,并按照常规方法制备杂交瘤细胞,应用间接ELISA方法筛选鉴定阳性杂交瘤细胞株。结果显示,成功构建了LIF(23-202)-pET30a重组质粒,获得了高纯度的LIF重组蛋白免疫原,得到1株能分泌大熊猫LIF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体亚型为IgG2b。Western-blot结果显示,LIF-2单克隆抗体可特异性识别大熊猫子宫内膜间质细胞、睾丸支持细胞、皮肤细胞、脐带间充质干细胞及骨髓间充质干细胞中的LIF蛋白。上述结果为阐明LIF的定位和组织表达信息,探讨LIF在大熊猫胚胎着床中的作用奠定了重要基础。