炭疽活疫苗家兔免疫力与血清抗芽胞IgG关系的研究

炭疽疫苗是预防炭疽流行和炭疽生物恐怖的重要手段。已有动物实验表明 ,炭疽活疫苗的保护力优于以保护性抗原为主要成份的无细胞疫苗 ,但两类现行疫苗都有待重新评价和改进。炭疽疫苗的效力必须用适当的实验室方法进行检测与分析才能了解其性质和细节。试验中力图探寻炭疽活疫苗家兔免疫力与血清抗芽胞抗体水平的关系。用“皮上划痕人用炭疽活疫苗”免疫家兔 ,以特定制备的炭疽芽胞抗原用ELISA法检测血清抗炭疽芽胞IgG抗体水平 ,并用强毒炭疽杆菌攻击进行效力试验。免疫家兔血清几何平均抗芽胞IgG滴度在免疫后一个月内持续升高 ,14d达到 2 0 6 ,2 8d时达到 776 ,这时其抵抗 2 0MLD毒菌攻击的保护率为 80 % ,符合中国生物制品规程要求的保护力。一个月后抗体水平开始下降 ,4 2d时滴度降至 2 2 3。实验所揭示的炭疽减毒活疫苗诱导的家兔抗芽胞IgG抗体与抗炭疽保护力之间的关系 ,既为评价现行疫苗提供了资料 。

炭疽芽孢杆菌噬菌体AP631的生物学特性检测

炭疽病(Anthrax)一直是分布较广、发病率较高的烈性传染病。病原菌的分离和鉴定是诊断炭疽病的关键手段。用特异噬菌体进行炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的鉴别具有快速、准确、简便等优点。董树林等于1963年分离到炭疽芽孢杆菌噬菌体AP631,从60年代就开始用于实验诊断,对其生物学特性曾进行部分研究。但目前对AP631所知甚少。本实验的目的在于为病原学诊断和AP631的进一步利用,提供数据和积累资料。

一株炭疽杆菌无毒株的建立

目的 建立无毒炭疽菌株 ,为炭疽疫苗研究和免疫检测打基础。方法 用传统的高温减毒法 ,将当前用于生产炭疽疫苗的减毒菌株进一步减毒。结果 对筛选的一株炭疽杆菌AAT12 1株进行全面检定 ,证实它已失去其亲代株A16R所具有的 pXO1质粒 ,并因此失去了产生毒素的能力 ,成为炭疽杆菌“无毒株” ;同时也几乎完全失去了生成芽胞的能力 ;其它的生物和生化学性质未发现变化。结论 炭疽减毒株也可用高温减毒法进一步减毒为无毒株 ,以便有关研究中应用。

中国的炭疽杆菌DNA分型及其地理分布

炭疽广泛分布于中国各地 ,特别是西部地区 ,并经常造成人畜疾病。在一项合作研究中 ,用多位点VNTR分析 (MLVA)对从 195 2～ 1998年自中国主要地理流行区域分离的病人、病畜和土壤等来源的炭疽杆菌进行了基因分型。MLVA分析结果揭示了 2 1种新的基因型 ,其等位基因组合在以前世界范围分离物的研究中未曾发现。此外 ,分离物的分群显示 ,A3b组是地理上最广泛分布的基因组 ,说明该组可能是中国的“地方流行株”。

XTT四唑鎓盐试验快速检测卡介苗活性

卡介苗生产中最重要的质检指标—活菌含量测定 ,传统固体培养计数方法时间需 2 1天以上 ,且结果有时不稳定、操作复杂。使用XTT[2 ,3 bis (2 methoxy 4 nitro 5 sulphenyl) (2H) tetrazolium 5 carboxanilide]做底物的四唑钅翁盐试验在活卡介菌的还原下快速显色 ,很好地反映出卡介苗活菌的浓度差异。实验观察在微孔培养板中反应经酶标仪测定的XTT试验非常简便易行 ,不受死亡细菌的影响 ,不受培养基的影响 ,实验重复性非常好 ,检测活性单位时间惊人地缩短为 2 4小时左右 ,检测活性范围大。此方法有潜力代替传统活菌计数法用于卡介苗生产中的活性单位测定。

炭疽毒素的细胞受体

炭疽杆菌外毒素是三组分蛋白质 ,构成两种毒素。水肿因子 (EF)和致死因子 (LF)分别是腺苷环化酶和金属蛋白酶 ,保护性抗原 (PA)与细胞表面受体结合并将水肿因子或致死因子转移进细胞内发挥毒性作用。在哺乳动物细胞上己发现有两种受体 ,分别是肿瘤内皮标志 8基因编码的细胞表面蛋白ATR/TEM8和毛细血管形态发生基因 2编码的细胞表面蛋白CMG2。这两种受体蛋白的生理功能都不十分清楚 ,它们之间的氨基酸序列有很高的同源性 (4 0 %～ 6 0 % )。氨基酸序列主要分信号肽、细胞外主基、跨膜区、脑浆尾四个区 ,细胞外主基内含vonWillebrand因子A主基或称整合素插入主基 (VWA/I主基 ) ,VWA/I主基内有金属离子依赖性粘连位点 (MIDAS) ,是主基与PA蛋白质相互作用所必不可少的。这两种受体都有几种异构体 ,主要差异在于胞浆尾区的氨基酸长度不同。两种VWA/I主基都有封闭PA功能 ,阻止细胞中毒的作用 。

对研发新型结核病疫苗的分析和展望

结核病是公共卫生当前面临的重要问题。由于BCG预防效果不佳,研究和开发新型结核病疫苗显得必须且急迫。新型结核病疫苗的研究开发路径和观念也经历了变迁,当前主流的研发路径有重组BCG或重组结核菌、重组痘病毒或重组腺病毒载体疫苗、蛋白质亚单位或重组融合蛋白质亚单位疫苗三类,它们在疫苗效力前景,抗原选型、配方、剂型,免疫应答,疫苗生产,疫苗质量控制,临床前研究动物试验,临床试验和使用,对结核病公共卫生政策的影响等方面各有优劣。新型结核病疫苗的成功研发,还需要病原学、发病机制、免疫学和疫苗研发科学的进一步努力。

炭疽杆菌荚膜研究进展

本文对炭疽杆菌荚膜的本质、在感染中的作用、合成与基因调控以及免疫原性进行了回顾。炭疽杆菌荚膜的研究进展使得对炭疽感染的机制,炭疽杆菌逃避宿主免疫系统的机制,机体对炭疽的免疫应答及其作用有了深入的了解。

布鲁氏菌BP26蛋白的表达纯化及其抗原性的研究

目的获得布鲁氏菌感染血清学诊断优势抗原BP26重组蛋白。方法应用PCR技术从布鲁氏菌减毒株(104M)中扩增出bp26目的基因片段,将其克隆于表达载体PET30a中,并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,用亲和层析纯化BP26重组蛋白,然后分别用Western-blot,间接ELISA检测其抗原性。结果DNA测序及酶切鉴定证实PET-30a/bp26原核表达载体构建成功,并在大肠杆菌中高效表达,免疫印迹和间接ELISA实验证明BP26重组蛋白可与布鲁氏菌阳性血清产生特异性结合。结论成功获得了布鲁氏菌中序列全长为696bp,编码232个氨基酸的BP26蛋白,通过血清学反应证实,该蛋白为人和动物布鲁氏菌病临床诊断试剂盒的研发奠定了基础。

人用皮内注射布氏菌活疫苗毒理及药效学研究

目的 研究人用皮内注射布氏菌活疫苗的毒理及药效学作用,以评价其可行性.方法 对布氏菌活疫苗进行小白鼠急性毒性试验、局部刺激试验、全身过敏试验、长期毒性试验及豚鼠皮肤变态反应试验并免疫小鼠,进行血清抗体检测.结果 小鼠皮内注射布氏菌活疫苗的最大耐受量为1.0×10^9个菌,用布氏菌素注射足底,可引起明显的迟发型变态反应.局部刺激试验,只有注射1.0×10^9个菌的部位会在48 h后化脓,但在1～2周内可自愈.全身过敏试验均未出现任何异常反应,毒性试验、各项血常规、血生化检查均未见显著差异,各脏器组织的病理学检查亦未见病理改变.免疫12周后,对豚鼠骨髓造血细胞亦无影响.对皮内免疫12周的豚鼠作背部皮肤变态反应试验,24～48 h结果为阳性.皮内免疫小鼠14 d后可测得小鼠体内有抗体产生,50 d后测得小鼠体内抗体均呈强阳性,对照组小鼠14 d与50 d抗体检测均为阴性.结论 毒理和药效学试验结果显示,布氏菌活疫苗用皮内注射的途径进行免疫是可行的.

鼠疫菌V抗原基因在大肠杆菌中的克隆及表达

从鼠疫杆菌野毒株总DNA中利用PCR方法扩增出V抗原编码基因 ,将此基因克隆到大肠杆菌的表达质粒pET 42b( + )中 ,经IPTG诱导后 ,在大肠杆菌BL2 1 (DE3)细胞中成功地表达出鼠疫菌V抗原蛋白。目的蛋白表达量占菌体总蛋白的 32 8%。

人用布氏菌疫苗浓度测定分光光度法的建立

目的研究人用布氏菌疫苗浓度与吸光度（A）值之间的相关性,建立用分光光度法测定待测疫苗吸光度值,经参考曲线得出其浓度的方法。方法确定分光光度法测定布氏疫苗浓度的特异性、测定波长及线性范围。4个专业实验室经对7批成品疫苗进行比浊,测定与细菌浊度标准管（相当于布氏菌浓度25亿.mL-1）浊度一致菌液的吸光度值及标准管对应浓度±20%（即30亿.mL-1和20亿.mL-1）菌液的吸光度值,根据该结果制备布氏菌疫苗浓度测定用参考品。4个实验室应用该参考品分别对布氏菌疫苗进行协作测定,确定分光光度法测定布氏菌疫苗浓度的可行性。结果确定600 nm作为吸光度测定波长,布氏菌疫苗浓度在10~50亿.mL-1之间时吸光度值与菌液浓度之间有很好的相关性（r=0.999,自由度=3,P〈0.01）。成功制备了3种浓度（即20、25、30亿.mL-1）的布氏菌疫苗浓度测定用参考品,其吸光度值分别为0.384、0.484和0.575。经4个实验室应用该参考品对布氏菌疫苗进行协作测定,测定误差小于5%。结论分光光度法具有良好的重现性,适用于布氏菌疫苗的浓度测定。

分光光度法测定鼠疫疫苗浓度方法的建立

目的研究鼠疫疫苗浓度与吸光度（A）值之间的相关性，建立通过测定A值来计算鼠疫疫苗浓度的方法。方法确定分光光度法测定鼠疫疫苗浓度的特异性、测定波长及线性范围。4个专业的实验室经对9批成品疫苗进行比浊，测定与细菌浊度标准管（相当于鼠疫浓度7．0亿／ml）浊度一致菌液的A值及标准管对应浓度±20％（即5．6亿／ml和8.4亿／ml）菌液的A值，根据该结果制备鼠疫疫苗浓度测定用参考品。4个实验室应用该参考品对鼠疫疫苗进行协作测定，确定分光光度法测定鼠疫疫苗浓度的可行性。结果确定600nm作为吸光度测定波长，鼠疫疫苗浓度在2．6—10．5亿／ml之间时A值与菌液浓度之间有很好的相关性（r=0．9998，df=3，P〈0．01）。成功制备了3种浓度（即5．6、7．0和8．4亿/ml）的鼠疫疫苗浓度测定用参考品，其A值分别为0．444、0．557和0．651。经4个实验室应用该参考品对鼠疫疫苗进行协作测定，测定误差小于5％。结论分光光度法具有良好的重现性，适用于鼠疫疫苗浓度的测定。

鼠疫菌F1抗体/抗原酶联免疫诊断试剂盒的应用评价

目的对兰州生物制品研究所有限责任公司研制的鼠疫菌F1抗体酶联免疫诊断试剂盒和鼠疫菌F1抗原酶联免疫诊断试剂盒进行临床应用评价。方法采用双抗原/抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接血球凝集试验(IHA)、胶体金免疫层析试验(GICA)3种方法的诊断试剂对比检测云南省地方病防治所中心实验室保藏的和现场采集的血清样品和脏器样品,对血清样品做鼠疫菌F1抗体检测,对脏器样品做鼠疫菌F1抗原检测。结果在358份血清样品中,ELISA试剂检出F1抗体阳性52份(14.52%),IHA试剂检出阳性37份(10.34%),GICA试剂检出阳性45份(12.57%)。ELISA与IHA试剂的符合率为95.23%,与GICA试剂的符合率为96.92%。经统计学χ2检验,ELISA试剂检出F1抗体阳性率高于IHA试剂(χ2=11.53,P=0.000 7),与GICA试剂检出的差异无统计学意义(χ2=3.27,P=0.070 4)。进一步分析滴度差值频数,ELISA试剂检测人血清的敏感性高于IHA试剂的样品占87.5%。在117份脏器样品中,3种试剂均检出F1抗原阳性15份(12.82%),符合率100%。滴度差值频数比较,ELISA试剂检测敏感性高于反向间接血球凝集试验(RIHA)试剂的样品为78.57%。结论兰州生物制品研究所有限责任公司研制的鼠疫菌F1抗体酶联免疫诊断试剂盒和鼠疫菌F1抗原酶联免疫诊断试剂盒性质特异,其敏感性优于IHA试剂盒和GICA试剂条,值得在鼠疫的监测和快速诊断中推广应用。

炭疽杆菌荚膜

在胞浆膜和肽聚糖层之外,炭疽杆菌(Bacillus anthracis)还有两层表面结构,称做荚膜和S-层.荚膜在繁殖体细胞的S层外,但其附着于细胞表面不需要S层.因为只有少数细菌同时具有这两种结构,所以说炭疽杆菌的构造非常复杂.……

鼠疫耶尔森菌rV抗原单抗系统及其ELISA检测方法的建立

目的建立ELISA双抗体夹心法,测定重组毒力因子rV抗原含量。方法采用杂交瘤技术,制备鼠疫菌rV抗原的鼠单克隆抗体,对抗原表位和单抗特异性进行分析及鉴定,建立ELISA双抗体夹心法,并验证方法的专属性、准确性、精密度和线性范围。结果成功组建了鼠疫菌rV抗原诊断试剂,灵敏度最低检测值为10 ng/mL。结论该方法可用于免疫学检测鼠疫组分疫苗原液rV抗原含量及制备过程中抗原活性,是鼠疫组分疫苗制备中一种重要的质量控制手段,也为进一步开发鼠疫诊断试剂盒及其他相关研究奠定了基础。

鼠疫溶菌疫苗免疫小鼠的体液免疫应答

为选择以F1抗原为主要有效成分的鼠疫溶菌疫苗(Whole cell lysate of Yersinia pestis vaccine,WCLY)的免疫程序,设计了这组试验。在37℃培养鼠疫EV菌,通过超声波裂解法制备鼠疫溶菌疫苗。设计(0,2周)、(0,4周)、(0,2,4周)三种免疫程序,以每剂总蛋白量7.9μg、31.5μg和126.0μg三个剂量皮下接种NIH小鼠。分别在第一针免疫后2、4、8、12周采集血清,通过间接ELISA检测抗鼠疫菌F1抗原和总抗原抗体。结果显示:免疫后血清抗体上升很快,2周内即可测出;无论哪种免疫程序,至12周时抗体滴度仍保持高水平;加强免疫后,抗体水平在4周或8周达到较高,可与活疫苗免疫者相比;溶菌疫苗的接种剂量为7.9μg时,动物只出现轻度不良反应。提示鼠疫溶菌疫苗需要两剂免疫,最短可间隔2周,接种剂量应不超过7.9μg,疫苗中应富含F1抗原。

重组鼠疫菌F1抗原在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析

利用基因重组技术,用pET42(b+)质粒在大肠杆菌DE3中表达鼠疫菌F1抗原。经分析rF1抗原基因序列与天然F1抗原结构基因序列完全一致,电泳扫描测其表达量为25%:W estern B lot结果表明,rF1抗原可与F1特异性抗体相互作用,具有天然F1抗原的活性。用镍离子亲和层析纯化rF1抗原免疫BALB/c小鼠,在其血清中可检测到高滴度的抗F1抗体。

重组鼠疫菌V抗原的纯化及其豚鼠免疫保护力初探

采用Ni2 +亲和层析方法 ,对用工程化大肠杆菌BL2 1(DE3)表达的重组鼠疫菌V抗原进行纯化 ,目标蛋白纯度达到 90 %以上。以氢氧化铝凝胶配制吸附疫苗 ,经二针次肌内注射免疫实验豚鼠后 ,对皮下注射 4 0 0个致死剂量 (MLD)强毒鼠疫菌攻击有一定保护效力 ,存活率为 2 0 %。结果表明 。