奶山羊SCD基因CDS区的克隆、序列分析及过表达

【目的】研究奶山羊硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(stearoyl-CoA desaturase,SCD)在乳腺上皮细胞中对不饱和脂肪酸合成过程相关基因的调控及对细胞脂肪酸组成的影响。【方法】用RT-PCR方法从西农萨能羊乳腺组织中扩增SCD基因,进行序列分析和组织表达谱分析;构建重组腺病毒质粒,进行包装和扩增后,感染体外培养的奶山羊原代乳腺上皮细胞,实时定量检测相关基因的表达,western blotting检测蛋白变化,气相色谱-质谱联用分析细胞内脂肪酸组成变化。【结果】①获得了全长1 080 bp的山羊乳腺SCD基因CDS(GenBank登录号:GU947654)并对其进行了生物信息学分析;②奶山羊SCD基因在乳腺、肺和皮下脂肪组织中高表达,而在心脏、瘤胃和卵巢组织中的表达量较低;③成功构建了奶山羊SCD基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒液,重组腺病毒感染原代乳腺上皮细胞后,检测结果表明细胞中SCD基因过表达极显著,FASN、H-FABP、LEPR和LXRα等基因表达下调,而PPARγ和LPL基因的表达量显著性增加;④棕榈酸和硬脂酸的含量下降,不饱和脂肪酸含量上升。【结论】SCD基因在奶山羊乳腺中发挥着重要作用,FASN、H-FABP、LEPR、LXRα、PPARγ和LPL基因的表达与其相关,这些基因共同影响乳脂中脂肪酸的组成。

西农萨能羊乙酰/丙二酸单酰基转移酶基因重组腺病毒载体的构建

本研究旨在通过构建西农萨能羊脂肪酸合酶(FASN)基因乙酰/丙二酸单酰基转移酶(MAT)区域的重组腺病毒载体,为研究其在奶山羊乳腺上皮细胞中过表达以及功能和作用机制做准备。根据GenBank收录的西农萨能羊MAT序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上并线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasyⅠ的E.coli Bj5183感受态细胞进行同源重组,得到重组腺病毒质粒pAd-MAT-HIS,并用PacⅠ酶切鉴定,将经过PacⅠ线性化的pAd-MAT-HIS转染HEK 293细胞进行病毒包装和扩增,用LaSRT法测定病毒滴度。将本次克隆的MAT序列与GenBank收录的山羊序列对比发现,在601bp处碱基由G转变为A,导致氨基酸序列由丙氨酸(Ala)201转变为苏氨酸(Thr)201。酶切鉴定、绿色荧光蛋白观察、PCR及Western blot检测均证明,重组腺病毒质粒构建成功,病毒滴度为2×109 PFU.mL-1。本研究成功构建了重组腺病毒pAdEasy-MAT-HIS。

奶山羊催乳素受体基因CDS区的克隆和序列分析与腺病毒干扰载体的构建

本文旨在克隆奶山羊催乳素受体（PrlR）基因CDS序列，在此基础上构建针对奶山羊PrlR的腺病毒干扰载体，为研究PrlR在奶山羊乳腺乳脂合成代谢中的功能与调控作用提供有效的RNA干扰工具。首先从西农萨能羊乳腺组织RNA中扩增得到完整CDS区序列，其CDS长为1746bp，包含581个氨基酸序列，GenBank登录号为JF966783；测序后进行序列分析和功能预测，奶山羊PrlR基因CDS区与其他反刍动物相应序列具有较高的同源性，其跨膜区为第236-258位氨基酸；然后根据测序得到的CDS序列，在线设计合成奶山羊PrlR的shRNA序列并成功构建重组干扰腺病毒载体；将这些载体在293细胞系中进行包装和扩繁，最终获取高滴度的腺毒，使用TCID50法检测病毒滴度为5．19×10^8PFU／mL。