岷江百合WRKY转录因子基因的克隆与功能分析

WRKY转录因子家族在植物应对非生物和生物胁迫的防卫反应中起重要作用。岷江百合(Lilium regale Wilson)是高抗枯萎病的野生百合,该研究基于前期转录组测序分析,采用RT-PCR方法从岷江百合中克隆得到WRKY转录因子基因LrWRKY4并分析其功能,以探讨岷江百合对枯萎病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)侵染的转录调控机制,为进一步研究岷江百合WRKY基因家族的功能奠定基础。结果显示:(1)LrWRKY4开放阅读框为993 bp,编码330个氨基酸,LrWRKY4含有一个高度保守的‘WRKYGQK’七肽序列和一个C2H2锌指基序,属于Ⅱc类WRKY转录因子。(2)成功构建GFP-LrWRKY4融合载体并通过根癌农杆菌介导转化洋葱表皮细胞,激光共聚焦显微观察发现,GFP-LrWRKY4融合蛋白表达的绿色荧光特异性地分布在洋葱表皮细胞的细胞核中。(3)成功构建了过表达载体pCAMBIA2300s-LrWRKY4并转化烟草,得到11个T2代转基因烟草株系,且转LrWRKY4基因烟草与野生型烟草(WT)在表型上无明显差异;尖孢镰刀菌接种根部和叶片的实验结果显示,转LrWRKY4基因烟草对尖孢镰刀菌的抗性较WT明显增强;qRT-PCR分析显示,岷江百合LrWRKY4基因在11个转基因烟草株系中均有表达,且转基因烟草中JA/SA信号途径相关基因的表达上调,并诱导了部分病程蛋白相关基因以及抗氧化相关基因的表达上调。(4)岷江百合鳞片浸染LrWRKY4 RNAi载体后的腐烂程度和病变面积均远大于RNAi空载转化的鳞片;瞬时表达LrWRKY4 RNAi载体的岷江百合鳞片中LrWRKY4基因的表达水平较对照下降了约45.7%,接种尖孢镰刀菌72 h后表达水平下降了93.8%;瞬时表达LrWRKY4 RNAi后,一些JA/SA信号途径相关基因的表达水平明显下降。研究表明,岷江百合LrWRKY4编码一个定位于植物细胞核的Ⅱc类WRKY转录因子;LrWRKY4基因能够在转基因烟草中稳定表达,且过表达LrWRKY4基因提高了烟草对尖孢镰刀菌的抗性;但瞬时表达LrWRKY4 RNAi降低了岷江百合JA/SA信号途径相关基因的表达并增强了对尖孢镰刀菌的敏感性。推测LrWRKY4基因是岷江百合抗尖孢镰刀菌防卫反应中的正调控因子,可能通过参与JA/SA介导的信号传导途径,诱导防卫相关基因的表达从而调节其对尖孢镰刀菌的抗性。

三七病程相关蛋白基因PnPR1的表达特性以及功能分析

该实验采用定量逆转录PCR(Quantitative reverse transcription-PCR)方法分析三七[Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen]病程相关蛋白(pathogensis related protein,PR)基因PnPR1的表达谱,并构建PnPR1的植物超表达载体,通过根癌农杆菌介导转入烟草(Nicotiana tabacum)中过量表达。结果表明:(1)外源茉莉酸甲酯预处理三七根部,能显著提高茄腐镰刀菌(Fusarium solani)侵染过程中PnPR1基因的表达量。(2)4种信号分子茉莉酸甲酯、水杨酸、过氧化氢和乙烯利处理均能够不同程度地提高PnPR1基因在三七根中的表达水平,但3种信号分子抑制剂处理三七根部后PnPR1的表达量下调。(3)PnPR1在T_(2)代转基因烟草中稳定表达,并且转基因烟草株系对茄腐镰刀菌的抗性显著提高。研究认为,PnPR1基因在转录水平上响应茄腐镰刀菌的侵染,并受茉莉酸甲酯等信号分子的诱导,在烟草中过表达PnPR1基因可增强对茄腐镰刀菌的抗性,表明PnPR1是三七应对根腐病菌防卫反应中的抗病基因。

岷江百合多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因及其启动子的克隆与分析

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)在植物抵御病原菌侵染的过程中具有重要的作用。从尖孢镰刀菌抗性百合野生种岷江百合中分离得到一个PGIP基因及其启动子。LrPGIP的开放阅读框长度为1008 bp,编码一个含有335个氨基酸残基的蛋白质,并具有7个富含亮氨酸重复结构域。LrPGIP与油棕、椰子、林烟草的PGIP同源性较高,分别为91%,94%,86%,且与单子叶植物海枣、粗柄象腿蕉、油棕、椰子的PGIP蛋白亲缘关系更近。LrPGIP在根、茎、叶、花、鳞片中均有表达,在根中的表达量最高,在鳞片中的表达量最低。LrPGIP的表达水平受尖孢镰刀菌的诱导,在接种尖孢镰刀菌后72 h表达量最高。植物信号分子水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、过氧化氢均诱导LrPGIP表达。LrPGIP受乙烯利诱导后的表达量最高,茉莉酸甲酯次之。LrPGIP启动子片段的长度为706 bp,具有激素以及胁迫响应等多个顺式作用元件。将LrPGIP启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的表达框转入烟草表达,G US活性明显受尖孢镰刀菌、交链格孢侵染以及氯化汞、氯化钠胁迫的诱导,同时还响应茉莉酸、水杨酸等防卫相关植物激素。氯化汞处理后的GUS活性上调幅度最大,其次是交链格孢和乙烯利。可见,LrPGIP启动子活性受植物激素、生物及非生物胁迫的诱导。上述结果表明,LrPGIP可能是岷江百合抵御尖孢镰刀菌侵染的重要抗病基因。

岷江百合病程相关蛋白4基因及其启动子的克隆与分析

为了揭示岷江百合(Lilium regale)抗枯萎病菌防卫反应的分子机制,从岷江百合转录组数据中挖掘了一个响应尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)侵染的病程相关蛋白(PR)4基因。通过RT-PCR和染色体步移扩增得到LrPR4的DNA序列及其启动子片段,并初步分析其功能。LrPR4包含一个长432 bp的ORF,编码143个氨基酸残基,具有保守的Barwin结构域,属于II类PR4。qPCR结果显示LrPR4在岷江百合的根、花和鳞片中均有表达,外源信号分子处理和尖孢镰刀菌侵染均诱导LrPR4的表达。LrPR4启动子片段长501 bp,具有MYB、MYC等转录因子结合位点、响应低温、干旱、光、生长素、水杨酸的顺式作用元件。将LrPR4启动子驱动的GUS基因转入烟草(Nicotiana tabacum)中表达,转基因烟草的GUS活性受植物激素茉莉酸甲酯和水杨酸以及病原真菌尖孢镰刀菌、交链格孢、厚垣镰刀菌的诱导。在大肠杆菌中表达并纯化的LrPR4重组蛋白对厚垣镰刀菌、尖孢镰刀菌的菌丝生长具有抑制作用。本研究为后续进一步研究岷江百合PR4蛋白的功能奠定了基础。