异长叶烯通过减少肠上皮细胞凋亡改善小鼠克罗恩病样结肠炎

目的探究异长叶烯(isolongifolene,ISO)对肠上皮细胞凋亡和2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠克罗恩病(Crohn's disease,CD)样结肠炎的作用及分子机制。方法动物实验:将小鼠随机分为Wild type(WT)组、2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)组和TNBS+ISO组,每组8只。TNBS组及TNBS+ISO组小鼠经直肠灌注TNBS构建结肠炎模型,TNBS+ISO组小鼠在造模后予ISO灌胃(10 mg/kg)干预,其余两组予等量生理盐水灌胃,第7天处死小鼠。检测小鼠体质量变化、疾病活动评分(disease activity index,DAI)、结肠长度,进行结肠组织跨上皮电阻(TEER)检测,根据HE染色计算结肠炎症程度评分,RT-PCR和ELISA法检测肠黏膜炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6]水平,TUNEL染色检测小鼠结肠组织细胞凋亡,Western blot和免疫荧光检测其凋亡蛋白(cleaved caspase-3/caspase-3和Bax)、抗凋亡蛋白(Bcl-2)和紧密连接蛋白(ZO-1和claudin-1)表达。细胞实验:TNF-α诱导肠上皮细胞Caco-2凋亡模型,进行ISO治疗,再加入AMPK抑制剂Compound C干预。TUNEL染色、Western blot和免疫荧光检测同前。基因功能注释(Gene Ontology,GO)富集预测ISO的生物学功能。然后用小鼠和Caco-2细胞进行机制验证:Western blot检测各组小鼠结肠组织及Caco-2细胞中p-AMPK/AMPK和p-PGC1α表达水平,TUNEL染色检测细胞凋亡。结果动物实验结果显示,ISO能缓解实验性结肠炎和肠屏障功能障碍,表现为小鼠体质量降低(P<0.05)、结肠长度缩短(P<0.05),DAI评分(P<0.05)、炎症程度评分(P<0.05)、TEER值(P<0.05)改善,结肠组织中促炎因子(TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6)(P<0.05)、紧密连接蛋白[ZO-1(P<0.05)和claudin-1(P<0.05)]的表达改善。细胞实验中,在TNF-α诱导的肠上皮细胞模型中也发现ISO能保护肠屏障受损。ISO减少肠上皮细胞的凋亡率(P<0.05)、cleaved caspase-3/caspase-3(P<0.05)和Bax(P<0.05)的表达,且上调Bcl-2(P<0.05)的水平。GO富集预测分析显示,ISO改善CD样肠炎可能与负向调控细胞凋亡有关。机制验证发现,p-AMPK和p-PGC1α在ISO治疗后的小鼠结肠组织和Caco-2细胞表达明显上调(P<0.05),而Compound C则升高了ISO治疗的Caco-2细胞的凋亡率(P<0.05)以及降低ZO-1、claudin-1的相对表达量(P<0.05)。结论ISO至少部分通过激活AMPK/PGC1α信号通路减少肠上皮细胞凋亡,从而缓解TNBS诱导的小鼠肠屏障功能障碍和CD样结肠炎。