TRPM2对小鼠脑缺血再灌注损伤中星形胶质细胞活化的影响

目的 探究瞬时受体电位M2(transient receptor potential melastatin 2,TRPM2)在小鼠脑缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)过程中对星形胶质细胞活化的影响。方法 在体实验:设置野生假手术(WT-sham)组、TRPM2敲除假手术(TRPM2^(-/-)-sham)组、野生脑缺血再灌注(WT-I/R)组、TRPM2敲除脑缺血再灌注(TRPM2^(-/-)-I/R)组,采用“线栓法”建立小鼠大脑中动脉I/R模型,采用Bederson评分方法评价小鼠神经功能缺损情况;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色评价小鼠脑梗死体积;免疫荧光染色观察小鼠缺血侧海马区及皮层缺血半暗带区星形胶质细胞的活化情况。离体实验:纯化培养原代星形胶质细胞并建立氧糖剥夺再灌注(oxygen and glucose deprivation-reperfusion,OGD/R)模型,Western blot检测各组细胞胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达情况。结果 在体实验中,与WT-sham组相比,WT-I/R组小鼠Bederson评分较高(P<0.05),脑梗死体积较大(P<0.05),缺血侧海马CA1、CA3、DG区及皮层缺血半暗带区GFAP荧光强度及阳性细胞数量增多(P<0.05);与WT-I/R组相比,TRPM2-/--I/R组小鼠Bederson评分降低(P<0.05),脑梗死体积减小(P<0.05),缺血侧GFAP荧光强度及阳性细胞数量显著减少(P<0.05)。离体实验中,与WT-CTRL(control,CTRL)组相比,WT-OGD/R组细胞GFAP蛋白表达量增高(P<0.05);与WT-OGD/R组相比,TRPM2^(-/-)-OGD/R组GFAP蛋白表达量降低(P<0.05)。结论 TRPM2敲除可抑制星形胶质细胞活化从而降低脑I/R损伤。

邻氨基苯甲酸抑制TRPM2通道对脑缺血再灌注损伤小鼠神经功能及小胶质细胞活化的影响

目的探究N-(对戊基肉桂酰基)邻氨基苯甲酸(ACA)抑制瞬时受体电位通道M2(TRPM2)对小鼠脑缺血再灌注损伤小鼠神经功能及小胶质细胞活化的影响。方法将48只C57BL/6雄性小鼠随机分为假手术组(Sham)、大脑中动栓塞再灌注组(MCAO/R)和TRPM2通道抑制组(ACA)。采用线栓法建立小鼠脑缺血再灌注损伤模型,采用Bederson评分法筛选损伤程度一致的模型进行后续实验。ACA组小鼠缺血2 h后腹腔注射25 mg·kg^(-1)ACA(TRPM2通道抑制剂)。再灌注24 h后,采用Bederson评分评价小鼠神经功能,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色评价小鼠脑梗死率,激光散斑血流成像监测小鼠大脑皮质脑血流量,苏木精—伊红染色法(HE)染色观察各组小鼠缺血侧颞侧皮质区、海马CA1、CA3及缺血半暗带区形态学变化;Nissl染色观察各组小鼠缺血侧颞侧皮质区、海马CA1、CA3及缺血半暗带区神经元数量的变化;免疫荧光染色观察半暗带区离子钙结合衔接分子1(Iba-1)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。结果与Sham组相比,MCAO/R组小鼠Bederson评分、脑梗死率均上升(P均<0.05);与MCAO/R组相比,ACA组小鼠Bederson评分、脑梗死率降低,大脑皮质缺血侧脑血量增加(P均<0.05)。HE及Nissl染色结果发现:与Sham组相比,MCAO/R组在缺血侧颞侧皮质区、海马CA1、CA3及缺血半暗带区均可见组织结构紊乱,细胞核固缩,嗜酸性细胞及淋巴细胞多见,神经细胞数量明显减少;与MCAO/R组相比,ACA组缺血侧颞侧皮质区、海马CA1、CA3及缺血半暗带区组织结构明显改善,炎性细胞明显减少,神经元数目明显增加,Iba-1、iNOS荧光强度减少,TNF-α表达量减少(P均<0.05)。结论ACA抑制TRPM2通道对脑缺血再灌注损伤小鼠具有保护作用,可能与ACA抑制小胶质细胞活化并减少炎性因子的分泌有关。

TRPM2通道对氧糖剥夺再灌注后小胶质细胞活化的影响及机制

目的探究瞬时受体电位M2(transient receptor potential melastatin 2,TRPM2)通道对氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)后小胶质细胞活化的影响及分子机制。方法采用线栓法建立小鼠大脑中动脉栓塞/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R),分为野生假手术组、TRPM2敲除假手术组、野生模型组和TRPM2敲除模型组,灌注切片,免疫荧光观察在体小胶质细胞形态。提取原代小胶质细胞,免疫荧光鉴定纯度,利用原代小胶质细胞建立(OGD/R)模型,将细胞分为野生对照组、野生模型组、野生模型+TRPM2通道抑制剂(ACA)组、TRPM2敲除对照组、TRPM2敲除模型组,使用免疫荧光观察OGD/R造模后小胶质细胞活化形态改变。在BV2细胞中建立OGD/R模型,将细胞分为空白对照组、模型组、模型+TRPM2通道抑制剂(ACA)组,利用活性氧检测试剂盒检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,使用酶联免疫吸附试剂盒检测细胞炎性因子分泌情况,钙成像检测细胞胞内钙含量。结果小鼠MCAO/R造模后,野生模型组在体小胶质细胞激活显著,TRPM2敲除模型组在体小胶质细胞激活受到抑制。原代小胶质细胞OGD/R造模后,野生模型组活化形态明显,TRPM2敲除模型组、野生模型+ACA组细胞活化受到抑制。BV2细胞OGD/R造模后,与空白对照组相比,模型组ROS水平上调(P<0.05),肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)分泌量增多(P<0.05)、胞内钙含量升高(P<0.05);与模型组相比,模型+ACA组的ROS水平下降(P<0.05)、TNF-α和IL-6分泌量减少(P<0.05)、胞内钙含量降低(P<0.05)。结论TRPM2通过钙离子在OGD/R中调控小胶质细胞活化及炎性因子分泌量。