建兰花叶病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)是引起兰科植物病毒病的最重要病原体。研究根据NCBI上已登录的CyMV外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因保守区设计两对特异性引物,用RT-PCR法从感病蝴蝶兰中克隆到2条CyMV CP基因序列,编码区ORF长672 bp,编码223个氨基酸。序列分析表明这两个分离物之间有13个核苷酸差异,与已报道的其他地区CyMV分离物CP基因核苷酸相似性分别为97%~99%和97%~98%,氨基酸相似性分别为95%~99%和96%~100%。运用实时荧光定量RT-q PCR法对该病毒检测方法进行了一系列条件优化,建立起一套基于SYBR Green I的CyMV实时荧光定量PCR检测体系。该检测方法比普通RT-PCR法灵敏度高100倍,标准曲线循环阈值(Ct)与模板浓度的对数呈现良好的线性关系,扩增效率为100%,相关性系数为0.998。重复性试验表明组内及组间变异系数均在2.58%以内,表明该方法重复性较好,可为兰花CyMV的早期预警及病毒在植物体内侵染途径研究提供技术支持。

菊花几丁质酶基因ChCHI的克隆及表达分析

根据GenBank发布的几丁质酶基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,克隆到菊花1个几丁质酶基因ChCHI(GenBank登录号为KX881373)。ChCHI基因cDNA全长为1 385 bp,包含960 bp开放阅读框,编码319个氨基酸。ChCHI属于亲水性蛋白,相对分子质量约为35.5 k D,等电点为6.38,为稳定蛋白,二级结构预测表明该蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主。蛋白序列比对和进化树分析表明,ChCHI基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族几丁质酶,与薇甘菊(ACO25187.1)几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,序列一致性为87%。qRT-PCR分析结果显示,SA处理可以明显提高贡菊叶片中ChCHI的表达量。菊花ChCHI在对抗环境胁迫的分子调控中起重要作用。

牡丹DGAT基因的克隆及表达分析

利用RT-PCR和RACE技术,从牡丹种子中克隆得到1个二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT),命名为PaDGAT1(GenBank登录号为MG214258)。PaDGAT1基因cDNA全长为2 028bp,包含1 554bp开放阅读框,编码517个氨基酸。PaDGAT1蛋白属于疏水性碱性蛋白,分子量为58.86kD,理论等电点为8.62,二级结构预测表明,无规则卷曲和延伸链是该蛋白的主要结构元件。氨基酸序列对比分析表明,PaDGAT1基因编码的蛋白属于DGAT1亚家族,与油橄榄(Olea europaea)的DGAT1蛋白亲缘关系最近。实时荧光定量分析结果表明,PaDGAT1基因在花芽中表达水平较高,在叶、茎和未发育子房中表达水平较低;在种子发育过程中,PaDGAT1基因表达水平呈现出升高-降低-升高的趋势,其中在发育28d时表达水平最高,随后其表达水平逐渐减低,在种子发育70d时又升高,至发育末期的85d时表达水平升高至较高水平;在种子收获后,常温存放7d时,PaDGAT1基因表达水平最高,随后其表达水平逐渐下降。结果推测,DGAT基因在牡丹种子的油脂合成中起重要的调控作用。

蝴蝶兰PhRCAβ基因的克隆及表达特性分析

为研究蝴蝶兰Rubisco活化酶(RCA)基因对低温胁迫的响应机制,以蝴蝶兰"满天红"为材料,分析了蝴蝶兰Rubisco活化酶基因PhRCAβ的全长序列(Gen Bank登录号为KU954548)及其表达特性。结果表明,PhRCAβ基因全长1 695 bp,编码440个氨基酸;其编码的蛋白具有RCA的特异位点,含叶绿体转运肽,定位于叶绿体中,其成熟蛋白的分子量为42.52 k D,等电点为蛋白5.54,属于RCA小亚基基因;该基因在绿色组织中转录表达;13℃/8℃(昼/夜)的低温胁迫抑制Ph RCAβ基因的转录表达,并随着低温胁迫时间的延长,PhRCAβ基因的表达水平逐渐降低,在温度恢复正常时其表达水平升高;4℃低温条件下,Ph RCAβ基因的表达水平随着低温处理时间的延长逐渐降低,并一直维持在较低水平。由此推测,PhRCAβ直接参与了蝴蝶兰叶片光合作用的调控。

牡丹种子总RNA提取方法比较

采用CTAB法、Trizol法及改进的RNA提取试剂盒方法提取牡丹种子的总RNA,比较三种方法的优劣,从而筛选出一种适合于牡丹种子高质量RNA的提取方法。结果表明,以RNA提取试剂盒为基础,当每管样品是25 mg(700μL裂解液)时,六管合一管过吸附柱的方法操作简单,且能够有效地去除牡丹种子中脂肪、多糖、多酚等代谢物质,从而提取出高质量的RNA。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示该法提取的RNA完整性好,紫外分光光度计检测其OD260/OD280比值为2.03。而且,该法提取得到的RNA被成功应用于荧光定量PCR表达分析等后续的分子生物学研究。