奶牛乳房炎主要病原菌EF-Tu蛋白同源性及T、B细胞抗原表位分析

奶牛乳腺炎是由病原菌感染引起的急性或慢性乳腺疾病,严重危害奶牛健康和影响奶业发展。随着病原菌耐药性不断增强,抗生素治疗奶牛乳腺炎的效果越来越不佳。因此,研究和使用疫苗预防奶牛乳腺炎越来越受到重视。引起奶牛乳腺炎的病原菌主要为无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌和埃希氏大肠杆菌等。能否从这些病原菌中寻找高度保守的共同蛋白质分子作为疫苗候选抗原是值得研究的课题。延伸因子-Tu(Elongation factor Tu,EF-Tu)是存在于真核细胞和细菌细胞内参与RNA翻译的常见功能蛋白。研究表明,多种病原菌的EF-Tu作为抗原均能够诱导良好免疫保护作用。因此,研究对分离得到的无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌和埃希氏大肠杆菌EF-Tu基因进行了Sanger法测序,然后对其编码蛋白的理化性质、结构、同源性、T细胞和B细胞表位等进行分析比较。结果显示,无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌EF-Tu由398个氨基酸组成;金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌EF-Tu分别由394、409个氨基酸组成,相对分子质量均为44 kda左右,且无规则卷曲占比较高;EF-Tu蛋白是一种无信号肽、无跨膜结构域的亲水性分泌蛋白,对其核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析显示,三种链球菌EF-Tu氨基酸序列同源性高于91%,与金黄色葡萄球菌、埃希氏大肠杆菌的同源性超过68%;对EF-Tu的T细胞表位和B细胞表位进行预测,得到11个IC50值小于50 nM的共同T细胞表位和7个阈值大于0.5的B细胞表位,说明具有交叉免疫原性,为进一步开展EF-Tu叉免疫原性研究提供参考。

Trap抗原诱导细胞免疫对S.aureus免疫保护作用的研究

金黄色葡萄球菌(S.aureus)是奶牛乳房炎的主要致病菌。实验利用S.aureus的Trap基因构建Trap/PET-32a表达质粒,IPTG诱导表达后柱层析纯化Trap蛋白,与弗氏佐剂混合制备疫苗,小鼠肌肉免疫,二免后7 d,分离小鼠脾细胞,经Trap抗原刺激后检测细胞因子,二免后14 d,小鼠眼球采血制备血清检测抗体,小鼠腹腔S.aureus Newman株攻毒2 d后,取小鼠的肝、脾、肺、肾,涂板检测细菌荷载量,攻毒7 d后制作病理组织切片。结果显示Trap蛋白免疫组比标签蛋白PET-32a对照组极显著增强了细胞因子IFN-γ,IL-4和IL-17A的表达水平与特异性IgG的表达水平;显著降低了细菌对小鼠各个器官的损伤与定植,攻毒保护保护率为56%。实验验证了S.aureus的Trap抗原小鼠免疫既增强了体液免疫又提高了细胞免疫水平,对小鼠有理想的免疫保护作用。