EBV-LMP1C端RNA的体外转录合成及其靶脱氧核酶的初步筛选

目的探讨用体外转录方法制备EBV-LMP1C端RNA并用该RNA对其靶脱氧核酶进行初步筛选。方法用巢式PCR方法从绒猴淋巴细胞系B95-8细胞中扩增EBV-LMP1exonc,重组入pGEM-11zf载体,并用T7RNA聚合酶对其进行体外转录制备EBV-LMP1C端RNA。根据该RNA的一、二级结构设计合成3种靶向10～23脱氧核酶,据体外剪切效率筛选高效特异的靶向脱氧核酶。结果成功地构建含EBV-LMP1exonc基因的重组质粒,用体外转录方法用1μg质粒转录出40.25μg高纯度的EBV-LMP1C端RNA,有1种脱氧核酶DZ1对该RNA体外剪切效率达89%。结论用T7RNA聚合酶体外转录方法成功制备了高纯度的EBV-LMP1C端RNA,经体外剪切筛选出高效特异的1种脱氧核酶,为进一步研究奠定了基础。

EB病毒LMP1C端原核表达质粒的构建

目的通过巢式PCR技术扩增EB病毒LMP1 C端,并构建其原核表达重组质粒,经诱导获得EB病毒LMP1C端蛋白。方法用巢式PCR技术,从B95-8细胞中扩增EBV-LMP1 exon c DNA,克隆至pET-32 a载体,转化入原核表达菌BL21,IPTG诱导重组菌株表达,用SDS-PAGE与W estern b lot对表达产物进行鉴定。结果巢式PCR扩增的LMP1exon c DNA长度为801 bp,测序结果与LMP1 C端cDNA序列吻合,诱导pET-32 a-LMP1 c重组原核表达菌株获得大小约48×103的LMP1 C端融合蛋白,W estern b lot表明重组蛋白能与LMP1单克隆抗体特异结合。结论通过巢式PCR成功构建了原核表达载体,获得的EB病毒LMP1 C端融合蛋白为制备国产LMP1单克隆抗体,研究LMP1致瘤机制奠定了基础。

重庆地区鼻咽癌患者血浆EBV-LMP1基因检测及缺失变异分析

目的:研究重庆地区鼻咽癌和非鼻咽癌患者血浆EB病毒潜伏膜蛋白l(EBV-LMP1)基因存在情况及碱基缺失变异状况,探讨其在鼻咽癌发生中的作用。方法:收集重庆籍鼻咽癌患者外周血48例,非鼻咽癌对照者外周血40例,提取DNA后,采用PCR特异性地扩增LMP1基因N端(包含Xho I酶切位点)和C端(包含30 bp缺失的区域),N端PCR产物进行Xho I酶切。用8%聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离分析酶切及PCR产物,用双脱氧终止法对部分PCR产物进行测序,用DNAssist软件对序列进行碱基缺失变异分析。结果:48例鼻咽癌外周血中,全部扩增出特异性LMP1基因条带,阳性率为100%。40例非鼻咽对照者外周血中,38例扩增出特异性条带,阳性率为95%。与B95-8原型LMP1比较,电泳分离、酶切分析、测序及软件序列分析,48例鼻咽癌患者和38例非鼻咽癌对照者外周血未发现1例存在LMP1基因N端Xho I酶切位点和C端30 bp的缺失变异。结论:我国重庆地区鼻咽癌患者和非鼻咽癌对照者血浆携带的EBV为非缺失型(原型);LMPl基因缺失变异与鼻咽癌发病的确切关系还需进一步研究。