miRNA-125b在牛病毒性腹泻病毒感染MDBK细胞中诱导细胞凋亡的研究

为研究miRNA-125b在致细胞病变牛病毒性腹泻病毒(cpBVDV)感染牛肾细胞(MDBK细胞)过程中诱导细胞凋亡的机制,本研究将cpBVDV感染MDBK细胞,并将构建的pcDNA-miR-125b转染MDBK细胞作为阳性对照。采用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测细胞中miRNA-125b和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)mRNA转录水平,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。检测结果显示,cpBVDV感染MDBK细胞12 h和24 h,细胞中miRNA-125b的转录水平分别为正常细胞对照组的2.01倍和3.85倍,Bcl-2 mRNA的转录水平分别为对照组的0.71倍和0.31倍;pcDNA-miR-125b转染MDBK细胞48 h后,Bcl-2 mRNA的转录水平为正常细胞对照组的0.42倍。细胞凋亡检测结果显示,cpBVDV感染MDBK细胞12 h和24 h,细胞的凋亡率分别为15.06%和36.43%;pcDNA3.1-miR-125b转染48 h,细胞的凋亡率为25.56%。结果表明miRNA-125b在cpBVDV感染MDBK细胞过程中能够通过抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA转录水平从而诱导细胞产生凋亡。

结核分枝杆菌CFP10基因真核表达质粒的构建及表达

为研究结核杆菌毒力因子CFP10在结核杆菌感染细胞过程中的功能,本研究根据GenBank中登录的结核杆菌H37Rv的CFP10基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到CFP10基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测序验证后,再将CFP10基因亚克隆至pEGFP-N1中,经核苷酸序列测定和酶切鉴定获得重组表达质粒pEGFP-N1-CFP10,分别转染293T细胞和U937细胞。经western blot分析表明CFP10-EGFP融合蛋白在293T细胞和U937细胞中均获得了表达。通过激光共聚焦显微镜观察显示在293T细胞和U937细胞,CFP10-EGFP融合蛋白主要分布于细胞质。本研究为进一步研究毒力因子CFP10在感染宿主细胞中的作用奠定了基础。

布鲁氏菌介导对细胞类泛素SUMO1表达影响的研究

为研究布鲁氏菌侵染细胞后对SUMO1表达的影响,本研究采用Ni柱亲和层析法纯化SUMO1蛋白,制备兔抗SUMO1多克隆抗体,布鲁氏菌M5-90和16M菌株分别侵染巨噬细胞后,通过免疫印迹方法和荧光实时定量方法分别检测细胞中类泛素SUMO1蛋白表达水平与mRNA转录水平。结果显示,表达并纯化了鼠源类泛素SUMO1蛋白,并制备了兔抗SUMO1多克隆抗体;布鲁氏菌M5-90和16M菌株侵染巨噬细胞后,SUMO1蛋白表达水平与mRNA转录水平在12 h内均呈现先上升后下降的趋势,M5-90菌株侵染4 h时SUMO1表达量最高(p<0.01),16M菌株侵染8 h时SUMO1表达量最高(p<0.01)。实验结果表明布鲁氏菌在侵染细胞时能够引起类泛素SUMO1表达的增强,对布鲁氏菌在宿主细胞中存活和细胞抗菌均起一定作用。

绵羊GM-CSF原核表达及蛋白功能检测

目的:构建GM-CSF原核表达载体,并诱导表达、纯化其蛋白。方法:将GM-CSF基因克隆至原核表达载体pET-32中,转化至BL21中,用智能蛋白质多维纯化系统(AKTAxpressTM)纯化目的蛋白,利用MTT法测定GM-CSF融合蛋白对绵羊外周血淋巴细胞的增殖活性。结果:成功获得了435bp的绵羊GM-CSF基因片段,诱导表达了35kDa融合蛋白GM-CSF,其纯度达95%以上,浓度达860mg/mL;通过MTT证明该融合蛋白对绵羊淋巴细胞具有增殖活性,其作用最明显的蛋白浓度是200μg/mL。结论:成功获得重组蛋白GM-CSF,该蛋白具有较好的生物活性,为免疫增强佐剂的开发奠定了基础。