C株猪瘟病毒NS3蛋白抗原表位分析及分段表达活性检测

以经典毒株C株的基因组为模板,测序后对NS3蛋白的二级结构进行分析,并对抗原表位进行预测,结果表明NS3的二级结构非常丰富并且存在丰富的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。截获3个不同的基因区域a、b和c,并设计相应的引物,分别扩增出约645、609和615 bp的靶基因,分别用pET-28a表达载体进行重组后,获得pET-28a-NS3a、pET-28a-NS3b与pET-28a-NS3c,用表达菌株BL21(DE3)进行表达,b段表达较高,可溶性表达较好,纯化后,可获得重组蛋白CSFV-His-NS3b, SDS-PAGE验证表达的重组蛋白大小约为27 kD,Western-Blot证实其具有良好的免疫原性,并且通过ELISA测得蛋白浓度约5 mg/mL,表明该蛋白特异性很强,可用于猪瘟诊断试剂盒的开发应用。

猪细小病毒VP2蛋白重组杆状病毒的构建表达与鉴定

为构建一种能够用于开发猪细小病毒病毒样颗粒疫苗的猪细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒。根据GeneBank数据库中的猪细小病毒全基因组序列设计并合成了1对能扩增VP2基因的引物,采用PCR扩增猪细小病毒BJ-2株的VP2基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得阳性质粒pFastBac-PPVVP2;测序后将该质粒转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,获得含有VP2基因的重组杆状病毒质粒Bacmid-PPVVP2;最后将获得的重组杆状病毒质粒Bacmid-PPVVP2转染Sf9昆虫细胞,并成功拯救了能稳定表达猪细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒Bacmid-PPV VP2。结果发现,该重组病毒可用于稳定表达猪细小病毒VP2蛋白,并且表达的VP2蛋白可在体外自我组装形成病毒样颗粒,电镜观测其颗粒大小与猪细小病毒全病毒大小类似,且形成的病毒样颗粒与全病毒一样具有豚鼠红细胞凝集作用,凝集效价可达1∶2048。故构建的表达猪细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒为研制猪细小病毒的基因工程亚单位疫苗奠定了基础。

猪细小病毒基因工程亚单位疫苗免疫程序制定

取实验室试制的安全性符合规定的3批次猪细小病毒杆状病毒载体灭活疫苗(rPP03株)分别免疫5~6月龄后备母猪、4~6月龄种公猪和经产母猪,免疫后不同时间采血,通过血凝抑制试验检测猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)血清抗体,观察抗体消长规律。根据试验结果确定该疫苗的免疫持续期和免疫程序:后备母猪5~6月龄免疫1次,2~3周后加强免疫一次;经产母猪于配种前1个月免疫一次;种公猪每6个月免疫一次,免疫持续期为6个月。