斑马鱼prkd1基因在心脏早期发育过程中的作用研究

为了探究蛋白激酶D(protein kinase D,PKD;又名PRKD)家族典型成员prkd1基因对早期心脏发育的影响,选用模式动物斑马鱼为研究对象,设计了吗啉代反义寡核苷酸敲低实验。表型观察结果显示,prkd1基因敲低会导致斑马鱼心脏发育异常,出现心包水肿、环化异常、心管线性化等畸形表型;斑马鱼心率分析数据显示,与野生型斑马鱼相比,prkd1基因的敲低会导致早期斑马鱼心率降低。利用转录组高通量测序技术对受精后3 d(3 days post fertilization,3 dpf)的斑马鱼对照组和敲低prkd1组进行测序,差异基因富集分析表明,prkd1的敲低与心脏相关信号通路如心肌细胞的肾上腺素信号通路等显著相关。进一步通过qRT-PCR对高通量测序结果进行验证,并对早期心脏发育关键因子进行检测,结果显示,部分心血管相关基因显著下调,tbx5a、gata4等心脏调控关键基因同样显著下调。这些表明prkd1基因可能通过调控心脏发育相关信号通路以及心脏发育关键基因来影响早期心脏发育,在早期心脏发育过程中发挥重要作用。

斑马鱼wbp11基因敲除品系的建立

WBP11是WW结构域结合蛋白家族的一员,参与前体mRNA剪接过程,是重要的剪接因子。斑马鱼作为重要的模式生物之一,其基因组中含有人类WBP11的同源基因wbp11。为了研究WBP11在脊椎动物早期发育过程中的作用机制,利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼wbp11基因敲除品系。首先,在wbp11基因的第二个外显子上设计基因敲除靶位点,体外转录合成sgRNA,通过显微注射技术对斑马鱼进行基因敲除,得到F0代嵌合体斑马鱼。随后,将嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交,所得到的F1代斑马鱼进行基因型鉴定,筛选出其中的杂合子斑马鱼,并对杂合子斑马鱼的缺失条带进行测序,结果显示其为wbp11基因的2种缺失突变。让同种突变的F1代杂合子斑马鱼自交,对得到的后代F2进行基因型鉴定,筛选获得了纯合子斑马鱼,表明wbp11基因敲除品系构建成功。经显微镜白光成像观察发现,受精后48 h的斑马鱼出现心包水肿、心脏线性化、骨骼弯曲畸形,这可能是由于wbp11基因突变引起剪接机制异常所导致的。此研究为探究WBP11基因在脊椎动物的早期发育中的作用机制开辟了道路。

人类T型钙通道α_(1H)亚单位基因在细胞增殖中的功能研究

将人类T型钙通道α1H 亚单位基因 (CACNA1H)cDNA转染到HEK 2 93(humanembroyonickidney)细胞系得到稳定过量表达的细胞株 ,以此为体外模型来研究T型钙通道在细胞增殖中的直接作用。RT -PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α1H 亚单位的过量表达。生长曲线结果表明 ,T型钙通道α1H 亚单位基因的过量表达能显著促进HEK - 2 93细胞增殖 ,将细胞群体倍增时间从对照细胞的 2 2 1± 1.1h缩短到稳定转染细胞的 14 0± 0 .4h ,细胞群体倍增时间缩短了约 8h ;流式细胞分析结果表明 ,在稳定转染细胞处于S期的细胞百分率比对照细胞高 ,相反地处于G1 期的百分率比对照细胞低 ,以上结果证明了过量表达T型钙通道亚单位α1H 基因能促进细胞增殖。Western印迹结果提示 ,T型钙通道α1H 亚单位基因表达产物是通过某种信号途径 ,提高了与细胞周期有关基因 (CDK2、cyclinA和cyclinE)的蛋白质表达水平 ,从而刺激了细胞周期的进程。

ICU医院感染状况的调查及预防对策

目的通过对ICU医院感染状况的前瞻性调查,结合ICU医院感染管理指南,提出预防对策,以期降低ICU医院感染发生率。方法2007年1月至2008年12月入住我院ICU患者纳入前瞻性调查,对分离菌株进行药敏试验并统计分析。结果ICU发生医院感染413例,60岁以上者占86.0%;医院感染发生率为13.3%。ICU患者器械相关感染发生率为23.89‰。下呼吸道感染占62.46%。留置导尿、中心静脉插管和呼吸机相关的器械相关感染发生率分别为8.21‰、6.81‰和30.26‰。本研究共分离出206株细菌,其中G+菌占37.4%,为金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、表面葡萄球菌和粪肠球菌;G-菌占62.6%,为铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。金黄色葡萄球菌株中甲氧西林耐药株占87.8%。大肠埃希菌中头孢曲松耐药株占54.5%;超广谱β-内酰胺酶(+)耐药株占50%。肺炎克雷伯菌株中超广谱β-内酰胺酶(+)耐药株占29.4%。铜绿假单胞菌株中环丙沙星耐药株占28.6%;多药耐药菌株占11.4%。鲍曼不动杆菌中亚胺培南耐药株占25.8%;泛耐药菌株占22.6%。结论年龄、基础疾病、侵入性操作和环境等是ICU医院感染的危险因素。

心肌细胞形成和分化过程中钙信号转导调控的研究进展

脊椎动物心肌细胞形成和分化是胚胎细胞一系列特定基因的精确转录表达过程,细胞内Ca2+信号转导系统在此起着重要的作用。该文对Ca2+依赖性转录过程:Ca2+/CaM/CaN/NF AT/GATA 4转录信号途径和Ca2+/CaM/CaMK/HDAC/MEF2转录信号途径指导下的心肌细胞的形成与分化研究进展作一综述。

人类T型钙通道α_(1G)和α_(1H)亚单位基因在细胞增殖中的功能

已经发现T型钙通道的表达与细胞增殖关系密切，然而T型钙通道的表达是细胞增殖的原因还是结果有待进一步研究。利用过量表达人类T型钙通道α_(1G)和α_(1H)亚单位基因(CACNA1G和CACNA1H)的HEK-293细胞研究了这两种基因在细胞增殖中的直接作用，通过RT-PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α_(1G)和α_(1H)亚单位基因的过量表达；从生长曲线分析得到了细胞群体倍增时间，HEKα_(1G)^+细胞为(13．7±0．3)h，HEKα_(1H)^+细胞为(14．0±O．4)h，都短于对照HEK-293细胞的(22．1±1．1)h，流式细胞分析结果表明，在稳定转染细胞处于S期的细胞百分率比对照HEK-293细胞高，相反地处于G_1期的百分率比对照HEK-293细胞低。结果表明，T型钙通道α_(1G)和α_(1H)亚单位基因的过量表达都能显著促进细胞增殖，这一作用可以被T型钙通道特异性阻断剂mibefradiL抑制，Western杂交结果提示了T型钙通道的过量表达是通过提高与细胞周期有关的蛋白质(CDK2，cyclinA和cyclinE)的表达水平刺激了细胞周期的进程从而促进细胞增殖。

湘云鲤和湘江野鲤血液指标的比较

报道了２１尾湘云鲤（ＣｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏＸｉａｎｇｙｕｎｎｅｎｓｉｓ）与２４尾湘江野鲤（ＣｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏＸｉａｎｇｊｉａｎｇｎｅｎｓｉｓ）血液中的红细胞数、白细胞数、血红蛋白值、红细胞脆性、比积、白细胞分类计数及各型血细胞大小（长径×短径）．比较了两种鱼上述值的差异，结果如下：湘云鲤的红细胞数、红细胞脆性、比积值显著低于湘江野鲤，白细胞数和血红蛋白无显著差异；两种鱼的白细胞分类计数均以淋巴细胞为主；各种血细胞大小都是湘云鲤显著大于湘江野鲤．

T型钙通道α_(1G)亚单位在细胞增殖中的功能研究

利用稳定过表达人类T型钙通道α_(1G)亚单位的HEK-293细胞研究了T型钙通道在细胞增殖中的作用。RT-PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α_(1G)单位的过表达的实现。生长曲线表明,T型钙通道α_(1G)亚单位的过表达能显著促进细胞增殖,HEKα_(1G)^+细胞的细胞群体倍增时间(13.7±0.3h)比对照HEK-293细胞的细胞群体倍增时间(22.1±1.1h)缩短了约8h;流式细胞分析结果也与此吻合,在稳定过表达了人类T型钙通道α_(1G)亚单位的细胞处于S期的细胞百分率比对照HEK-293细胞高,相反地处于G_0/G_1期的百分率比对照HEK-293细胞低,以上结果证明过表达T型钙通道α_(1G)亚单位能促进细胞增殖;T型钙通道特异性阻断剂mibefradil抑制HEKα_(1G)^+细胞增殖,IC_(50)为3.5/μmol/L,表明在HEK-293细胞过表达T型钙通道对细胞增殖的促进作用可以被T型钙通道特异性阻断剂mibefradil抑制,这就进一步证明了T型钙通道在促进细胞增殖方面的直接作用。Western杂交结果提示了T型钙通道α_(1G)亚单位的表达是通过某种信号途径提高了与细胞周期有关的蛋白质,cyclin A、cyclin E和CDK2的表达水平,从而刺激了细胞周期的进程。本研究有助于理解细胞增殖的机制并为开发治疗与细胞增殖异常有关疾病的新药提供了理论依据。

非甾体抗炎药抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖

本文研究了aspirin、ibuprofen和sulindac三种不同结构的非甾体抗炎药(NSAID)对大鼠A10血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响并探讨其作用机制。方法:细胞计数法观察不同浓度的三种NSAID对细胞增殖的影响,乳酸脱氢酶(LDH)释放分析法测定NSAID的细胞毒作用,流式细胞术分析测定细胞周期。结果:aspirin、ibuprofen和sulindac三种NSAID都对A10 VSMC的增殖有明显抑制作用,且其作用是浓度依赖性的,IC_(50)分别是:aspirin为1666μmol/L,ibuprofen为937μmol/L,sulindac为520μmol/L;其抑制作用不是因细胞毒作用引起;三种NSAID对细胞周期的作用不同,ibuprofen(1000μmol/L)和sulindac(750μmol/L)将细胞阻抑在细胞周期的G_1期(从68.7±2.0%上升到76.6±2.2%和75.8±2.2%,P<0.05),而aspirin(2500μmol/L)对处于细胞周期各期的细胞百分率无明显改变;利用有丝分裂抑制剂nocodazole辅助分析,更清楚地检测到了ibuprofen和sulindac在G_1阻抑,而aspirin仍然不引起处于细胞周期各期的细胞百分率的明显改变。结论:aspirin抗A10 VSMC的增殖作用机制与ibuprofen和sulindac两者的作用机制不同,本研究为三种NSAID成为VSMC增殖性疾病的治疗药物提供了理论依据。

干细胞在细胞移植法治疗心肌损伤中的应用

干细胞是指同时具有自我更新和产生分化细胞的增殖性细胞 .干细胞具有分化成多种机体组织细胞 ,包括心肌细胞的潜能 .把胚胎干细胞和成熟组织干细胞分化成心肌细胞的体内和体外实验 ,以及把这些分化出的心肌细胞用于细胞移植来治疗心肌损伤的可能性加以总结 .虽然干细胞用于治疗心肌损伤的细胞移植疗法具有广阔的前景 。

形成性评价在护理技能教学中的应用

目的探讨形成性评价应用于护理技能教学和考核的效果。方法选取我校护理专业2个班学生70人,甲班36人为对照组,采用传统评价方法;乙班34人为实验组,实施形成性评价方法;比较两组学生的考核成绩。对实验组学生问卷调查其对形成性评价的意见。结果实验组护理技能考核总评成绩评为优的比例明显高于对照组(P<0.05),评为优、良的比例明显高于对照组(P<0.01),评为中的比例亦明显低于对照组(P<0.01)。实验组学生问卷调查结果中对形成性评价反映良好者占85.7%。结论形成性评价有利于提高护理技能教学质量和学生综合能力。

浅析中专卫校护理毕业生就业工作中的市场意识

针对2009年上海市中专卫校护理毕业生就业难这个社会焦点现象,从中专卫校就业模式的演变、护理毕业生就业难的市场状况以及就业职能部门当前亟待解决的关键问题进行分析,并围绕就业职能部门应如何树立市场意识、推进就业工作作一粗浅的论述。

利用RNAi技术研究果蝇心脏发育基因的功能

RNAi是近两年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法。它通过导入一段与内源基因同源的双链RNA序列(dsRNA) ,使内源mRNA降解 ,从而达到阻抑基因表达的目的。目前已在线虫、果蝇、臭虫、真菌及植物等生物中建立RNAi技术 ,用于研究某些特定基因或已知基因在特定发育时期的功能。对于难于获得突变体的基因或生物体 ,RNAi技术尤其有效。虽然果蝇心脏发育基因wingless和tinman在果蝇心脏发育的早期功能已经清楚 ,它们都与果蝇心脏前体细胞的形成有关 ,但它们在果蝇心脏发育的后期功能仍有待进一步研究。实验运用RNAi技术 ,分别将tinman和wingless的dsRNA注入果蝇的早期胚胎 ,得到了这两个基因的dsRNA干扰表型 ,与两个基因的突变体表型非常相似 ,都表现为果蝇心脏前体细胞不能形成或心脏管缺失。尤其是tinman基因的dsRNA ,还引起了肠中胚层缺失和体壁肌肉组织的紊乱 ,而wingless基因的dsRNA却只影响心脏的形成 ,而不影响肠中胚层 ,说明dsRNA干扰具有非常强的特异性 ,因而不失为研究果蝇心脏发育基因功能的有效方法。

不同倍性鲫鲤鱼血液及血细胞的比较

对异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和二倍体红鲫血液指标 (红细胞数、血红蛋白值、红细胞脆性、比容 )、细胞大小 (红细胞及细胞核、白细胞、血栓细胞的长、短径值 )及它们的显微结构进行了比较研究 ,并观察了四倍体鲫鲤血细胞亚显微结构 .结果表明 :在不同倍性鱼中 ,四倍体、三倍体、二倍体红细胞在数目、脆性、比容方面随倍性的降低而依次升高 ;血红蛋白无显著差异 ;在细胞大小上 ,四倍体、三倍体、二倍体的红细胞及细胞核、嗜中性粒细胞、单核细胞表现出4∶3∶2的比例关系 ;在红细胞的形态方面 ,异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫存在明显差异 .同时发现随着倍性的升高红细胞的短径 /长径比值减小 .在异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫外周血中 ,均可观察到红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和血栓细胞 ,未发现嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞 .但三倍体湘云鲫、二倍体红鲫的嗜中性粒细胞仅有Ⅱ ,Ⅲ两种类型 ,未见含深紫红色颗粒的Ⅰ型嗜中性粒细胞 .对不同倍性鱼在血液细胞中出现的共同性和差异性进行了讨论分析 .

果蝇nulp1特异性多克隆抗体制备及检测

为了利用果蝇模型研究nulp1蛋白在早期心脏发育中的功能,采用PCR技术扩增出果蝇nulp1基因的部分编码区并插入到pET28a表达载体中.之后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3);通过IPTG诱导表达His-nulp1融合蛋白,该融合蛋白采用Ni2+金属螯合层析纯化后,免疫新西兰兔制备了多克隆抗体,利用west-ern blot对抗体进行分析.结果表明获得了高效价的特异性兔抗f-nulp1多克隆抗体.这为进一步研究果蝇心脏发育的分子机制创造了条件.

人工诱导雌雄同体革胡子鲇自体受精后代的胚胎发育研究

本文研究了革胡子鲇自体受精后代的胚胎发育过程。用每克含３０μｇ甲基睾丸酮的饲料投喂革胡子鲇仔鱼６０天，获得具自体受精功能的雌雄同体革胡子鲇，对雌雄同体鱼人工催产，获得自体受精的胚胎、仔鱼及全雌的成鱼。自体受精后代的受精率、孵化率都较高，说明人工诱导雌雄同体革胡子鲇产生的后代的自体受精过程及胚胎友育过程没有生理障碍。

Ti－24Al－14Nb－3V－0．5Mo合金的超塑性

研究了温度及应变速率对Ｔｉ－２４Ａｌ－１４Ｎｂ－３Ｖ－０．５Ｍｏ（ａｔ．－％）合金超塑性能的影响．试验结果表明，在９８０℃，３．５×１０^（－４）ｓ^（－１）的最佳超塑变形条件下，合金显示出较高的超塑性；应变速率敏感性指数ｍ为０．６９，拉伸延伸率Ｅｌ．为８１８％．根据其细小的α_２＋β_０两相组织和等温拉伸的试验方法，确定合金的超塑性属于细晶组织超塑性．在超塑变形过程中，合金无空洞产生，显微组织发生动态粗化．

人类新基因RMND5A的克隆及功能研究

克隆了一个新的人类Lish/CTLH结构域基因,经国际基因命名委员会批准命名为RMND5A.该基因位于染色体2p11.2,长3 239 bp,编码391个氨基酸,其结构域从N端起依次为LisH、CTLH与CRA.RT-PCR分析表明该基因在人类早期胚胎的多个组织中有表达,在心脏、肝和肾中的表达水平较强.对该基因的蛋白进行了表达并制备了多克隆抗体.荧光素酶活性测定分析表明,在COS7细胞中过表达蛋白可以使MAPK信号途径的两个下游转录因子ELK-1和AP-1的转录活性显著下降,表明RMND5A通过MAPK信号途径参与了对细胞生命活动的调控过程.

稳定表达人ASB12的C2C12细胞系的建立及鉴定

ASB12(homo sapiens ankyrin repeat and SOCS box containing 12)蛋白含有5个ANK(ankyrin repeat sequence)序列和一个保守的SOCS(suppressor of cytokine signaling)盒结构域,是ASBs(human ankyrin repeat andSOCS box containing protein family,ASB family)家族的成员.人类ASB12基因在成体心肌和骨骼肌组织中特异表达,是成肌分化的候选基因.利用阳离子聚合物转染技术将重组表达质粒pCMV-tag2B-ASB12转染小鼠骨骼肌细胞系C2C12细胞,通过G418筛选、免疫荧光检测、RT-PCR分析、Western blotting检测建立了稳定表达ASB12的细胞系C2C12-ASB12,为研究ASB12在骨骼肌发育及其相关功能提供有用的细胞研究模型.

G_β类似蛋白─WDR26对细胞增殖的影响

WD40重复序列蛋白是一类结构保守、功能复杂的蛋白.关于此类蛋白和细胞内信号传导途径的研究显示,该家族成员很可能通过调控胞内信号转导而影响细胞基本生命活动.在此前的研究中,我们报道了一个新基因WD40repeatprotein26的克隆.其初步研究结果显示WDR26蛋白与MAPK信号途径的负调控相关.在最近的研究中,我们构建了稳定转染pCMV-WDR26表达载体的HeLa细胞系,结果显示WDR26蛋白在HeLa细胞系中的过度表达,能够促进细胞分裂,加快细胞的倍增速度.因此,WDR26很可能具有通过MAPK信号途径调节细胞增殖的功能.