基于18S rRNA和HSP70基因序列的隐孢子虫种系发育分析

为阐明河南区域隐孢子虫分子流行病学特点,用PCR技术扩增分离虫株的18S rRNA基因全序列和HSP70基因序列,并对扩增片段进行测序。用PAUP 4.0和TREEPUZZLE 4.1构建进化树,试图从分子水平证明河南省不同地区不同宿主来源隐孢子虫的遗传特征,以阐明隐孢子虫病的分子流行病学特点。通过18S rRNA基因全序列和HSP70基因序列分析,其结果:河南人源隐孢子虫分离株为Cryptosporidium parvum鼠基因型;河南鹿源隐孢子虫分离株为C. parvum鹿基因型;河南猪源隐孢子虫的2个分离株均为C. parvum猪基因I型,即C. suis;河南鹌鹑源的隐孢子虫2个分离株分别为C. baileyi和C. meleagridis;河南乌鸡源隐孢子虫和鸵鸟源隐孢子虫分离株均为C. baileyi;河南牛源隐孢子虫分离株为C.andersoni。

人源隐孢子虫分离株种类鉴定与种系发育关系分析

目的确定郑州某医院分离到1株隐孢子虫(PRHN)所属种/基因型。方法用PCR对该分离株18S rRNA、HSP70、Cpn60和AOX进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序,扩增序列经用DNAstar和ClustalX与GenBank参考序列比对,用PAUP4.0构建种系发育进化树,以确定该分离株与其他隐孢子虫虫种之间的亲缘关系。结果通过18S rRNA、HSP70基因分析该分离株与Cryptosporidium parvum(C.parvum)鼠基因型同源性最高,分别为99.9%和99.2%,在种系发育树上,PRHN均与C.parvum鼠基因型亲缘关系最近;对Chaperponin 60(Cpn60)和Alternative oxidase(AOX)进行序列分析时,该分离株与本实验室分离到的猪隐孢子虫(C.suis)亲缘关系最近。结论该分离株为C.parvum鼠基因型。

人源隐孢子虫小白鼠感染模型的建立

为评价2种常用免疫抑制方法对小白鼠排人源隐孢子虫卵囊规律的影响,将19日龄小白鼠随机分成2组,第1组通过饮水给予地塞米松,第2组采用导胃管灌服地塞米松。第7 d,2组小白鼠灌胃接种人源隐孢子虫,每只小白鼠感染量为1.5×106个卵囊。两组均在感染当天就有卵囊排出,感染后第6 d粪便卵囊计数明显增加,随之出现3个高峰期,此后逐渐下降。免疫抑制组小白鼠在卵囊持续期不断有死亡但无腹泻症状。试验结果表明,用这2种免疫抑制方法,均能成功感染人源隐孢子虫,但通过灌服地塞米松可使小白鼠获得更高的OPG(每克粪便中的卵囊数)值和更长的排卵囊持续期。

隐孢子虫线粒体研究进展

隐孢子虫病是一种重要的人兽共患的原虫病,目前尚无用于治疗隐孢子虫病的特效药物。线粒体是真核生物中拥有蛋白和酶最多的细胞器,因而隐孢子虫线粒体也可能成为药物潜在的作用靶位。最近一些研究表明隐孢子虫存在线粒体诱生的细胞器,但和其他原生动物的线粒体存在着差异。隐孢子虫具有退化的线粒体,但缺少线粒体基因组,完全依赖核基因来编码所需的功能蛋白。本文对隐孢子虫线粒体存在的依据及其可能具有的功能作一综述。

用CPN60基因序列研究隐孢子虫种系发育关系

本试验以编码线粒体功能性蛋白Chaperonin 60（CPN60）的核基因作为研究对象,对隐孢子虫分离株CPN60基因进行扩增测序,用Clustal X1.81对扩增序列与GenBank相关参考序列进行比对,然后用PAUP4.0程序中邻接法（Neighbor-joining,NJ）、最大简约法（Parsimony,MP）构建基因树,同时用TREEPUZZLE程序Version4.1构建最大似然树（Maximum likelihood,ML）,以确定不同隐孢子虫虫株之间的进化关系,并以18S rRNA和HSP70基因构建的进化树作参照,评价CPN60是否更适合作为隐孢子虫基因分型和进化关系的分子标记。结果显示：基于CPN60构建的进化树将隐孢子虫分为两大类：C.baileyi和C.meleagridis处于一个分枝,C.hominis、C.suis、C.parvum牛基因型和C.parvum鼠基因型处于另一个分枝上。不同隐孢子虫之间的同源性介于96%-100%,能有效区分隐孢子虫不同基因型。因此,CPN60基因序列也可作为隐孢子虫分离株种系发育的遗传标记。

基于PNO基因序列分析隐孢子虫种系发育关系

本文以核基因组的功能蛋白丙酮酸∶NADP^＋氧化还原酶（pyruvate∶NADP^＋ oxidoreductase,PNO）编码基因作为研究对象,对本实验室分离保存的隐孢子虫虫株进行扩增测序,用ClustalX 1.81对扩增序列与GenBank相关参考序列进行比对,用Paup4.0程序中邻接法（Neighbor-joining method,NJ）、最大简约法（Parsimony,MP）和最大似然法（Maximum Likelihood,ML）进行聚类分析,以确定不同隐孢子虫分离株之间的遗传进化关系,并以18S rRNA和HSP70基因构僵的基因树作参照,进而评价PNO这一基因座是否适合作为隐孢子虫基因分型和进化关系分析的基因座。结果表明通过PNO构建的进化树将隐孢子虫分为2大类：Cryptosporidium bailey和C.meleagridis处于一个分枝,C.hominis、C.parvum牛基因型和C.parvum鼠基因型处于另一个分枝上。不同隐孢子虫之间的同源性介于95.0%-100%,能有效区分隐孢子虫不同基因型。因此,PNO基因序列也适合作为隐孢子虫分离株种系发育的遗传标记。

猪源隐孢子虫Hsp70基因的测定与种系发育关系分析

从河南两个地区猪的粪便中分离纯化了猪源隐孢子虫卵囊。参考隐孢子虫Hsp70基因属特异性引物，用PCR分别扩增了卵囊基因组DNA大小均为1948bp的片段，PCR产物经电泳鉴定后用试剂盒回收纯化，纯化后PCR产物直接测序。将测得的序列和推测出的氨基酸序列分别用ClustalX软件与已报道的相应序列比对，用DNASTAR中的MegAlign分析其同源性，并用PAUP绘制系统发育进化树。序列分析结果显示河南猪源隐孢子虫两个分离株Hsp70DNA序列的同源性为99．90．4，与其他隐孢子虫相应序列同源性介于81．9％～99．8％之间，其中与猪隐孢子虫（Cryptosporidiumsuis，AF221533）同源性最高分别为99．8％，97．9％；与安氏隐孢子虫（C．andersoni，AY954592）同源性最低。两个分离株推导Hsp70氨基酸序列的同源性为100％，同其他隐孢子虫相关序列的同源性在92．8％～99．8％之间。本研究为隐孢子虫诊断及流行病学研究打下了良好基础。

基因芯片技术在传染病防治中的应用

基因芯片(BiologicalChip)技术是一种大规模平行检测生物分子的有效手段,兴起于20世纪90年代初。由于其快速、微量准确的应用优点,已成为新一代的自动化医学检验工具。本文着重介绍生物芯片技术的种类、原理以及基因芯片在传染病防制中的应用。

人源隐孢子虫小鼠感染模型的组织病理学观察

建立了人源隐孢子虫动物感染模型,确定人源隐孢子虫在模型动物体内的寄生部位及组织病理学变化,以小鼠为接种对象,设计不同接种剂量,于接种后不同时间段剖杀小鼠.结果表明,免疫抑制组和非免疫抑制组均能感染隐孢子虫,使用免疫抑制剂组均能有效建立起隐孢子虫动物感染模型;人源隐孢子虫寄生在小鼠的十二指肠、空肠和回肠,在感染早期主要寄生在空肠和回肠,在感染中后期主要寄生在十二指肠和空肠,在虫体寄生部位有典型的组织学变化.

鹌鹑隐孢子虫流行病学调查及动物感染试验

为掌握畜禽隐孢子虫病在河南省的流行动态,作者于2003年用饱和蔗糖溶液漂浮法检查了郑州、焦作2市7个鹌鹑养殖场429份粪便样品.结果有5个鹌鹑场隐孢子虫感染为阳性,根据卵囊形态初步鉴定1种为贝氏隐孢子虫(Cryptosporid iumbaileyi),另1种为火鸡隐孢子虫(Cryptosporidiummeleagridis);总阳性率为14.69%(63/429),其中感染贝氏隐孢子虫的阳性率4.66%(20/429),火鸡隐孢子虫的阳性率为10.02%(43/429).并分别用2种卵囊试验感染鹌鹑和雏鸡研究其致病性,观察了2种隐孢子虫在鹌鹑体内的排卵囊规律,以及火鸡隐孢子虫在免疫抑制雏鸡和非免疫抑制雏鸡体内的排卵囊规律.

鹌鹑源火鸡隐孢子虫在小白鼠和雏鸡体内内生发育阶段的超微结构比较

用鹌鹑源火鸡隐孢子虫(Cryptosporidium meleagridis)卵囊分别感染昆明系小白鼠和固始雏鸡,用透射电镜和扫描电镜观察比较了C.meleagridis在两种试验动物体内的内生发育虫体超微结构和致病性的差异。利用扫描电镜观察发现,鹌鹑源火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)在小白鼠和雏鸡体内的寄生部位有较大差异,在小白鼠体内寄生于十二指肠,但在雏鸡体内主要寄生于回肠;C.meleagridis深嵌于小白鼠肠微绒毛丛内,微绒毛较为完整;但在雏鸡回肠,C.meleagridis似黏附在肠黏膜表面,微绒毛脱落明显,对雏鸡致病性明显比对小白鼠的致病性强。利用透射电镜在两种试验动物的样品中均观察到不同发育阶段的滋养体、裂殖体和大配子体以及正在孢子化的卵囊。滋养体和裂殖体在发育过程中可明显见到粗面内质网结构,裂殖生殖中期阶段粗面内质网尤其发达;小白鼠体内的C.meleagridis虫体与肠黏膜接触处形成一凹陷,寄生部位较深,而在雏鸡体内无此现象。此外,利用透射和扫描电镜均观察到虫体寄生部位周围微绒毛密度高而且也比其它部位长。形成这些差异的原因有待于进一步探讨。

隐孢子虫卵囊不同计数方法的比较

应用PBS液计数法、孔雀绿染色计数法和3种甘油卵囊原液(甘油∶卵囊原液分别为1∶2,1∶1,2∶1)计数法,对同一样本中牛安氏隐孢子虫卵囊进行了计数和比较。结果表明,孔雀绿染色计数法具有灵敏、特异和易操作等特点,是一种比较好的隐孢子虫卵囊计数方法。

贝氏隐孢子虫不同感染剂量对樱桃谷鸭的致病性

为了确定贝氏隐孢子虫对鸭的致病性,本试验分为2×105、4×105、8×105、16×105、32×105、64×105个卵囊剂量组,实验感染2日龄樱桃谷品种雏鸭。从感染鸭的排卵囊情况、临床症状、组织病理学变化、病理形态学变化比较了不同剂量组的致病情况。结果表明,贝氏隐孢子虫主要引起呼吸困难症状,气管炎和法氏囊炎病变。其致病性与剂量有明显的相关性。贝氏隐孢子虫有较强致病性,而且病程较长,但其致死率较低。

猪囊尾蚴抗原成分及其诊断价值分析

猪囊尾蚴病是一种重要的人畜共患寄生虫病。囊尾蚴病的快速诊断是囊尾蚴病治疗和预防的前提,免疫学诊断方法是近年来的囊尾蚴病临床诊断中的重要辅助手段,高特异性诊断抗原的筛选为近年来的研究热点。囊尾蚴抗原组成复杂,包括囊液抗原、头节抗原、囊壁抗原、循环抗原和排泄分泌抗原等。其中的囊液抗原特异性较好,可用于免疫学诊断,而排泄分泌抗原诊断囊尾蚴的价值尚待进一步研究。

PCR技术在原虫病诊断中的应用

聚合酶链反应(Polymerasrchainreaction,PCR)作为一种快速体外基因扩增技术,因其操作简便、敏感性好、结果可靠等优点,近年来在生物医学的各个领域得到广泛应用。本文就PCR技术在原虫病诊断中的应用,做一综述。

新型微载体培养系统中BHK-21细胞的生长特性研究

使用BellCell-500AP生物反应器和BioNOC○R-Ⅱ微载体,对BHK-21细胞在此新型高密度培养生物反应器中的生长特性进行研究。将含有1.5×108个BHK-21细胞的细胞悬液加入含有微载体的生物反应器内,待细胞贴附后加入细胞生长液,每日取载体计算细胞总数,观察BHK-21细胞的生长特性,并分析葡萄糖消耗规律。经过6d培养载体中细胞总数达到峰值,细胞密度是起始接入数量的31倍(4.41×109个),并且葡萄糖日消耗量与细胞增殖速度具有一定的相关性。试验成功实现了BHK-21细胞的高密度培养,为以BHK-21细胞为生产基质的病毒疫苗生产提供了一条简便快捷的途径。

BHK21细胞在新型微载体培养系统生长条件优化

目的:使用BelloCell-500AP生物反应器和BioNOC-II微载体,对BHK21细胞在此新型高密度培养生物反应器中的生长特性进行研究。方法:首先将1.5×108个BHK21细胞悬液加入含有微载体的生物反应器内,按生物反应器厂家推荐参数进行培养,每天取载体计数观察BHK21的生长特性。然后调整细胞浓度和微载体培养系统运行参数。结果:BHK21细胞经过6 d培养载体中细胞总数达到峰值,细胞密度是起始接入数量的31倍为4.41×109个;经过培养过程参数优化,确定适于BHK21细胞高密度培养参数。试验成功实现了BHK21细胞的高密度培养,为以BHK21细胞为生产基质的病毒疫苗生产提供了一条简便快捷的途径。