检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法的建立及初步应用

鹅细小病毒(GPV)是一种主要侵害雏鹅和雏番鸭的病原,给养禽业带来了巨大的经济损失.利用GPV的VP3基因保守区域设计了一对引物和探针,经反应体系的优化,建立检测鹅细小病毒的恒温隔绝式荧光PCR方法(ii PCR方法),并与TaqMan荧光定量PCR方法比较.结果显示,该方法能特异性检出GPV,对其他常见无关病原不检出,特异性好;检测下限是38.1拷贝·μL-1,灵敏度高;批内、批间变异系数均小于5%,重复性好;该方法对31份临床疑似样本的检出率为93.54%,高于TaqMan荧光定量PCR方法的检出率(83.87%).本研究为鹅细小病毒的现场快速检测提供了新的技术手段.

三重PCR检测鱼类致病性嗜水气单胞菌

【目的】建立一种能够快速准确地检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。【方法】根据嗜水气单胞菌的16S rRNA、气溶素基因(aer)和丝氨酸蛋白酶基因(ahp)的保守序列设计了3对引物,然后进行了PCR反应条件的优化、特异性和敏感性的检测并与普通的细菌分离鉴定进行了临床样本和人工攻毒样本检出率的比较。【结果】该方法特异性好,只对致病性嗜水气单胞菌呈阳性扩增;敏感性高,最低可检测100fg的细菌DNA模版。对临床疑似黄鳝(Monopterus albus)样本的检出率为81.8%,高于细菌分离的40.9%;对人工攻毒鲫鱼(Carassius auratus)样本的检出率为87.5%,高于细菌分离的67.5%。【结论】本方法的成功建立,实现在同一反应管中同时对16SrRNA、aer和ahp的检测,避免了只针对aer或ahp单个毒力基因的PCR检测方法可能存在的漏检和误检,为致病性嗜水气单胞菌的诊断、大规模检疫、流行病学调查等提供了一种快速、准确而有效的检测方法。

传统发酵牦牛酸奶中马克斯克鲁维酵母菌的分离鉴定及系统发育分析

对川西北部分牧区的10份传统发酵牦牛酸奶样品进行酵母菌的分离,通过常规形态特征和26S rRNA基因测序分析鉴定出16株马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)。同源性分析显示16株分离菌与已知马克斯克鲁维酵母的同源性高达99.3%~100%。16株分离菌中形成明显的两种序列类型,其中10株分离菌与另外6株分离菌相比在扩增片段的第537位点上发生碱基缺失、第554位点上碱基由G突变为A、第564位点上碱基由A突变为T。系统进化分析显示两种序列类型的分离株也形成两个独立进化分支。

川西北牧区传统发酵牦牛酸奶中发酵毕赤酵母菌的分离鉴定

对川西北部分牧区的10份传统发酵牦牛酸奶样品进行酵母菌的分离，通过常规形态特征和26SrRNA基因测序分析鉴定出6株发酵毕赤酵母菌（Pichia fermentanzo同源性分析显示6株分离菌与已知发酵毕赤酵母菌的同源性高达99．7％～100％。实验结果为该地区传统发酵牦牛酸奶中微生物组成多样性研究以及发酵毕赤酵母菌遗传多样性研究提供参考。

辣椒素降糖降脂的机理研究进展

辣椒素是一种香草酰胺类生物碱,是从辣椒中获取的活性物质,近年的国内外研究表明辣椒素具有降糖降脂的功效。本文综述了辣椒素通过与辣椒素受体结合、调节褐色脂肪组织和白色脂肪组织、释放脂肪细胞因子、改变肠道菌群结构、调节饮食和肌肉组织功能等几种途径发挥降糖降脂作用的机理,以期为辣椒素作为降糖降脂药物或者保健产品的开发利用提供参考依据。

微生物-肠-脑轴对肥胖调控的研究进展

肥胖已经成为一种全球性的流行病,严重威害人们的健康和生命,预防和治疗肥胖是世界各国面临的重大公共卫生挑战。越来越多的研究发现肥胖的发生和发展与肠道菌群有着密切的关系,肠道菌群与肥胖之间的调控机制成为研究的热点。微生物-肠-脑轴是肠道菌群参与的肠道和大脑的双向信息交流系统,是大脑和肠道功能相互整合、相互调节的途径。近年国内外的研究表明,微生物-肠-脑轴在肥胖调控方面具有重要的贡献,很多物质通过该途径发挥降脂减肥功能。本文综述了肥胖的严峻现状、微生物-肠-脑轴的组成以及调控肥胖的机制,以期为治疗肥胖等代谢疾病提供思路,也为一些降脂物质的机理研究提供了方向。

基于CRISPR/Cas9技术构建TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人结直肠腺癌细胞Caco-2中的辣椒素受体基因TRPV1,构建TRPV1基因敲除的Caco-2稳定细胞系.使用CRISPR/Cas9在线靶点设计程序在TRPV1基因4个转录本的公共CDS区的第一个外显子DNA区域中设计一对gRNA,将gRNA构建到真核重组表达质粒的载体上,电转染待敲除细胞,经嘌呤毒素抗性筛选和基因测序获得敲除TRPV1基因的稳定细胞系.用Western Blot检测TRPV1基因蛋白表达量验证Caco-2中TRPV1基因的敲除效果,CCK-8检测TRPV1基因敲除细胞的生长曲线,与野生型细胞对比检测TRPV1基因敲除对细胞生长的影响.筛选出TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系,而且TRPV1基因敲除对Caco-2细胞生长无显著影响.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系,为后续研究辣椒素对肠道脂类吸收影响的机理研究提供了有利的工具.

一株藏猪源奇异变形杆菌的分离鉴定及药敏试验

本研究从某藏猪场发病仔猪病料中分离细菌,对分离菌进行形态学、染色特性、生化特性鉴定,并分析16S rDNA基因同源性,同时进行了药敏试验。分离鉴定结果得出:分离菌呈多形性,多为革兰氏阴性短杆菌,少数为长杆状,在SS培养基上形成中心黑色、边缘白色的单菌落;生化反应对鸟氨酸脱羧酶、尿素酶、葡萄糖、柠檬酸盐、山梨醇、硫化氢等呈阳性反应;分离株16S rDNA基因的PCR扩增目的条带约为1410 bp,在GenBank上进行同源性比对,与奇异变形杆菌的相似度为99%。从形态学、生化特性和16S rDNA序列分析结果鉴定出所分离的菌株为奇异变形杆菌。药敏试验结果显示:菌株的耐药性很强,只对头孢他啶、氧氟沙星、庆大霉素、阿米卡星、氟苯尼考、左氧氟沙星、麦迪霉素等敏感。

鸭源致病性大肠杆菌的血清型鉴定及其相关毒力基因分析

自规模化养鸭场患典型大肠杆菌败血症雏鸭分离的282株致病性大肠杆菌(E.coli)中鉴定出210株(包含37种血清型),其中O93、O78、O92、O76占43.8%(92/210)为优势血清型,O46、O32&O93混合型、O60&O93混合型为首次从鸭群中分离到。应用PCR结合核酸序列测定对210株致病性E.coli(鸭大肠杆菌病分离株)和28株自健康雏鸭泄殖腔拭子分离的E.coli(临床健康鸭大肠杆菌分离株)进行包括强毒力岛(HPI)中的鼠疫菌素受体基因(fyuA)和铁调节蛋白基因(irp2)、I型菌毛必需蛋白基因(fimC)、P型菌毛结构基因(papA)和血清耐受基因(iss)检测,结果表明:fyuAi、rp2、fimC、papA和iss基因在鸭大肠杆菌病分离株的携带率分别为41.0%、43.3%、92.9%、97.6%和96.7%,在临床健康鸭大肠杆菌分离株的携带率分别为21.4%、25.0%、92.9%、100%和92.9%,患病鸭和临床健康鸭大肠杆菌分离株iss、fimC和papA携带率差异不显著(P>0.05),但papA的携带率均显著高于其他宿主(鸡、猪和人)源E.coli;HPI毒力岛在鸭源E.coli中分布较广,其携带率表现为鸭大肠杆菌病分离株极显著高于临床健康鸭大肠杆菌分离株。HPI毒力岛的携带率与菌株的致病性呈明显的正相关,与O78等特定的血清型有一定的关系。鸭大肠杆菌病分离株有37.6%(79/210)同时携带fyuAi、rp2、fimCi、ss和papA基因,极显著高于健康鸭大肠杆菌分离株的14.3%(4/28)(P<0.01)。

永川豆豉发酵过程中总糖和氨基酸变化与滋味的形成

通过采集传统发酵过程中的永川豆豉样本,对其总糖、还原糖、糖化酶活性、总氨基酸、游离氨基酸构成进行测定。结果表明,在成品豆豉游离氨基酸中,鲜味氨基酸占总游离氨基酸的23.98%,鲜味风味突出。豆豉中甜味氨基酸和还原糖共同构成了其回甜的滋味特点。豆豉中短链脂肪酸和乳酸使其呈现一定的酸味,酚类物质和苦味氨基酸呈现一定的苦味。这些最终决定了永川毛霉型豆豉的特有的咸鲜回甘风味特点。

川西北牦牛3种病毒性腹泻病血清学调查

本研究旨在了解川西北牦牛病毒性腹泻病的流行情况,为防制这类疫病提供一定科学依据。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对来源于川西北阿坝州8县的1070份牦牛血清中牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)和牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)进行了抗体检测。结果显示,BVDV、BCV和BRV抗体平均阳性率分别为44.3%、84.1%和94.4%。结果表明,BVDV、BCV和BRV感染在川西北牦牛中普遍存在,需进一步加强该地区牦牛病毒性腹泻疾病的综合防制。

永川豆豉发酵过程中质构色泽形成规律

永川豆豉采用传统发酵工艺发酵,大豆经过发酵后其质构和色泽都发生了显著的变化。通过对传统发酵过程中大豆各发酵阶段色泽、纤维素酶活性、硬度、黏聚性、弹性、咀嚼性指标进行测定,以及切片染色观察。并对色泽与氨基酸态氮关系进行回归分析。发现豆豉发酵过程中咀嚼性的变化趋势与豆豉硬度变化趋势一致。豆豉的黏聚性和弹性与浸泡、蒸煮等物理因素无关,浸泡和蒸煮对其指标没有明显改变,只有在进入后发酵阶段出现降低的趋势。豆豉发酵过程中色差变化,L*(亮度)变化明显,在整个发酵过程中一直呈下降趋势,豆豉在发酵过程中一直在向黑色转化。通过回归分析发现豆豉L*变化与其氨基酸态氮含量呈负相关,色差L*能解释氨基酸态氮变量的86.00%,可以用L*预测豆豉氨基酸态氮含量。

山羊腹泻粪便中奇异变形杆菌的分离鉴定及系统发育分析

该研究从四川成都某羊场腹泻简阳大耳山羊粪便中分离鉴定出奇异变形杆菌（14/20）,随机选取5个菌株腹腔注射小鼠,5×108 CFU/只,小鼠于接种后12h内全部死亡。PCR扩增分离株的16SrRNA序列,测序结果显示其与GenBank中奇异变形杆菌的序列同源性为99%-100%,分离菌株间的同源性为99.8%-100%;系统发育分析结果显示,分离菌株与不同宿主源奇异变形杆菌共聚为2个分支,存在一定的多样性,但其进化不存在显著的地域及宿主相关性。本研究结果表明,奇异变形杆菌与山羊腹泻密切相关,对养羊业的危害及公共卫生学意义值得关注。

规模化养鸭场鸭源大肠杆菌分离株的致病性及系统发育分析

为研究鸭源大肠杆菌(E.coli)的致病性,明确鸭病原性E.coli与人和其他动物E.coli的亲缘关系及O血清型与菌种间遗传关系的相关性,本研究从我国西南地区规模化养鸭场患典型E.coli败血症的雏鸭体内分离37个血清型共82个E.coli分离株(其中优势血清型32株,其他血清型50株),以每株0.2 mL(l09 cfu/mL)腿部肌肉接种7日龄健康鸭进行致病性试验;并对其中14个鸭源E.coli代表株进行16S rRNA基因克隆、测序及系统发育分析。结果表明:所有分离株全部为致病性E.coli,其中高致病株、中等致病株和低致病株分别占受试菌株的80.5%(66/82)、17.1%(14/82)和2.4%(2/82),4个优势血清型全部为高致病株和中等致病株,分别占受试菌株的84.4%(27/32)和15.6%(5/32);14个代表株鸭源E.coli的16S rRNA形成2个主要分支,3株新发现的血清型单独形成一个较远的分支,11株常见血清型与人及其他动物源E.coli形成另一个大的分支,其中有6株与人的O157亲缘关系较近,2株与出血性E.coli O157∶H7 sakai聚为一个小分支;从遗传进化的关系分析,这些菌株有可能是人类的潜在病原菌;同时还发现不同血清型的分离株可以聚为一支,而同一血清型的分离株可以处于不同的分支,常规的O血清学分型不能体现菌种间遗传关系的远近。

鸭致病性大肠杆菌外膜蛋白型研究

测定了从我国分离到的130株鸭病原性大肠杆菌外膜蛋白型（Outer membrane protein patterns,OMP型）,其中O93、O92、O78和O76优势血清型53株,O46等30个其他血清型分离株77株,这些分离株共产生了4个OMP型,其中OMP-1型81株,占62.3%（81/130）,覆盖O93、O92、O78和O76等29个血清型,占85.3%（29/34）,为主要的OMP型;根据GenBank中大肠杆菌K-12外膜蛋白A基因（ompA）的核苷酸序列设计引物,从9株优势血清型和1株O46血清型的鸭大肠杆菌中分别扩增得到ompA基因,进行序列测定及分析,发现优势血清型9个菌株的ompA均由1 171个碱基组成,均只有1个大的开放阅读框（ORF）,长1 053 bp,编码由350个氨基酸组成的前外膜蛋白A（pro-OmpA）,前21个氨基酸残基组成信号肽,成熟的OmpA由329个氨基酸残基组成;O46菌株的ORF全长1 041 bp,在400-411 bp位缺失了12个碱基,成熟的OmpA由325个氨基酸残基组成;10个鸭致病性E.coli的ompA基因核苷酸序列高度同源,相似性达95.8%~100%。

嗜水气单胞菌的研究进展

回顾了嗜水气单胞菌的生物学性状、血清型、致病性以及致病机理的研究情况,并概述了嗜水气单胞菌的致病毒力因子和诊断检测技术方面的研究情况及新的研究进展.

绵羊肺炎支原体灭活疫苗的研制

绵羊肺炎支原体引起绵羊及山羊非典型肺炎,分布广泛,危害严重。本试验旨在研制绵羊肺炎支原体灭活疫苗。采用改良Thiaucourt’s培养基对绵羊肺炎支原体临床分离株SC02进行培养,收集生长滴度达109 CCU/mL的培养物,浓缩20倍后灭活,制备油佐剂疫苗。选择绵羊肺炎支原体抗体阴性的6月龄健康山羊经颈部皮下接种该疫苗5.0mL/只(2×1010CCU/mL),免疫后21d,试验组与对照组山羊经气管接种绵羊肺炎支原体强毒Y98株5.0mL/只(≥2×1010 CCU/mL),测量体温、观察临床症状,并于攻毒后30d剖检,观察肺脏病理变化。结果表明,试验组5只山羊均获得免疫保护,全部精神状况良好,临诊和剖检均未见异常;对照组5只山羊出现咳嗽、发热、流鼻涕等症状,剖杀后见肺脏组织有典型的肺炎病理变化。本研究结果表明,该疫苗对山羊有良好的免疫保护作用。

川西北牦牛传染性鼻气管炎血清学调查

旨在了解川西北地区牦牛传染性鼻气管炎的流行情况,为制定合理的防疫措施提供一定的科学依据。应用竞争性酶联免疫吸附试验(c-ELISA)对川西北阿坝州6县的460份牦牛血清中传染性鼻气管炎病毒(IBRV)抗体进行了检测。结果表明,460份牦牛血清样品中,共检测出IBRV抗体阳性血清356份,平均阳性率为77.4%(356/460)。说明川西北地区牦牛感染IBRV普遍,需引起高度重视并采取有效的防治措施。

绵羊肺炎支原体和溶血性曼氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测绵羊肺炎支原体(MO)和溶血性曼氏杆菌(Mh)的方法,本研究根据MO的hsp70基因和Mh的gcp基因分别设计引物,建立了同时检测这两种病原的双重PCR检测方法。实验结果显示该方法能够特异性的扩增MO(135 bp)和Mh(227 bp)DNA片段,其最低检出量分别为2.06×103拷贝/μL和6.37 cfu/mL,与单一PCR相同。该方法对常见的致病菌无交叉反应。对临床样本的检测结果显示MO和Mh的检出率分别为56.25%和52.50%,与单独PCR符合率为100%。研究结果表明,本研究所建立的双重PCR检测方法具有特异性强、敏感性高等特点,为临床上MO和Mh混合感染的快速检测、鉴定以及流行病学调查提供了方便、快捷、准确的方法。

多重PCR方法检测鸭源产志贺氏毒素大肠杆菌

为了检测产志贺毒素大肠杆菌(STEC)在鸭源大肠杆菌中的分布情况,本研究建立检测STEC的多重PCR方法,针对STEC特有的毒力基因stx1、stx2、hlyA和eaeA筛选了4对引物,通过对PCR反应条件的优化、特异性和灵敏度的检测,建立检测STEC的多重PCR,并应用该方法调查254株鸭源致病性E.coli和115株外表健康鸭的泄殖腔分离的E.coli中STEC的分布情况。在254株鸭源致病性E.coli中检测出6株STEC,从外表健康鸭的泄殖腔分离的115株E.coli中未检测到STEC。检出的STEC的血清型分别为O36、O60、O77、O78、O158和O7&O92。本实验建立的检测STEC的多重PCR方法特异性好、灵敏度高;对鸭源E.coli的检测结果证实鸭致病性大肠杆菌中存在STEC菌株,分布频率较低,但其血清型具有广泛的宿主源,存在引起人类疾病的可能性。