一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法的建立及对Atsttrin-TNFR2相互作用的分析

创建一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法,用于蛋白质间相互作用分析.利用已确定具有相互作用的Atsttrin和TNFR2蛋白对作为实验对象,分别构建GST-Atsttrin和TNFR2-EYFP融合蛋白的原核和真核表达体系.将纯化的GST-Atsttrin与TNFR2-EYFP蛋白孵育后,经离心收集复合物,通过酶标仪检测其荧光值,从而分析Atsttrin和TNFR2间的相互作用.通过荧光值的检测成功分析了Atsttrin和TNFR2间的相互作用,荧光值的检测可代替传统方法中的Western blot分析,从而简化GST-pull down分析步骤、降低操作难度、并可对缺乏特异性抗体的靶蛋白进行有效地分析.

瑞替普酶在乳酸乳球菌中的表达

为建立溶栓药物瑞替普酶(r PA)的乳酸菌表达系统,从实验室前期构建的大肠杆菌表达质粒p ET22b-rpa上扩增出目的基因rpa,将该基因与乳酸菌表达质粒pCYT连接,构建了pCYT-rpa质粒.此外,为提高r PA在乳酸乳球菌NZ9000中的稳定性,同时构建了rpa位于葡萄球菌(Staphylococcal)耐热核酸酶基因nuc下游融合表达的重组质粒pCYT-nuc-rpa.将质粒p CYT-rpa和p CYT-nuc-rpa分别电转化至乳酸乳球菌NZ9000中,经Nisin诱导表达,Western blot结果显示Nuc可提高r PA在乳酸乳球菌中的稳定性,从而增加了rPA在乳酸菌中的表达量.重组r PA及Nuc-rPA在复性后均具有溶栓活性,活性分别为800,U/L和1,000,U/L.

Atsttrin在大肠杆菌中的表达和条件优化研究

Atsttrin是颗粒蛋白前体(Progranulin,PGRN)的截断突变体,具有比PGRN更强的TNFα受体拮抗能力,从而可产生更显著的抗炎治疗效果。为了筛选出高表达Atsttrin原核表达系统,致力于为抗炎新药的开发奠定工作基础,故开展该研究。研究以人血管内皮细胞(HUVEC)的c DNA文库为模板,PCR克隆得到pgrn基因,进而通过重叠PCR成功扩增获得atsttrin目的基因。分别将atsttrin插入到p ET-22b(+)、p GEX-6p-3和p ET-40b(+) 3个不同的表达载体上,并转化大肠杆菌BL21(DE3)、Rosetta(DE3)得到6株表达菌株。通过测定各菌株蛋白表达量,E. coli BL21(DE3)/p GEX-Atsttrin菌株中目的蛋白的表达水平最高。为进一步提高表达量,对诱导温度、诱导时期、诱导剂浓度和诱导时间进行了优化。实验结果表明诱导表达最佳条件为37℃培养到A600为1. 0时加入终浓度为3 mmol/L的乳糖,30℃诱导培养12 h,在此条件下进行5 L发酵罐诱导10 h后重组蛋白产量为550 mg/L。作者成功建立了Atsttrin的大肠杆菌表达系统,并对其表达条件进行了优化,从而为相关药物的开发奠定了工作基础。

知难而进 锲而不舍 努力把“红旗车分队”建设引向深入

海军某仓库保管三队，是一个车辆勤务分队。主要担负海军特种装备物资的收发保管及部队战备训练、工程建设和生产生活等运输勤务保障任务。多年来，在部队党委正确领导和上级业务部门的大力支持帮助下，坚持把“红旗车分队”评定工作作为分队全面建设的一项重要内容，常抓常议，有力地推动了分队各项工作的稳步发展。