L-酪氨酸连续发酵工艺研究

当前工业上用微生物发酵法生产L-酪氨酸的工艺中,基本都是前期向发酵罐内加入基础培养基,中后期再流加各类营养物质,虽然整个发酵过程中减少了取料和放料的操作,保证发酵中物料不被浪费,但是,随着流加物质的不断增加,发酵液体系不断扩大,该过程在发酵后期需要不断地人为调控发酵参数,而人为调控中,难以避免调控参数波动,并最终影响发酵结果。因此,实验采用高效连续发酵,该工艺可以大大提高菌体活力,并且有效延长产酸高峰期,为了优化L-酪氨酸的高密度连续发酵生产工艺,通过对大肠杆菌TYR-05发酵培养,考察了L-酪氨酸发酵过程并且分析了菌体量、产酸量、产酸效率、糖酸转化率的情况,确定L-酪氨酸高密度连续发酵过程中接种量、糖速率、糖耗量、底糖浓度等关键条件,以达到高密度连续发酵工艺控制条件优化。实验结果表明在5 L发酵罐中,选择30%的种子接种量,发酵起始时,底物氯化胆碱浓度为1 g/L并每4 h向罐内流加0.2 g/L的氯化胆碱,发酵至12 h时,底糖耗尽,开始以12 g/(L·h)的补糖速率向罐内提供葡萄糖,并在此时开始放液,放液速率为0.13 L/h,使得装液量恒定在20%左右,发酵25 h时开始流加复合营养液,发酵35 h时最高菌体OD_(600)达到65,产酸量为55.8 g/L,糖酸转化率为25.4%,为L-酪氨酸连续发酵工业化生产提供了重要参考。

磷酸盐与生物素最适浓度配比对谷氨酸发酵影响的研究

在L-谷氨酸发酵中,磷酸盐和生物素的添加量直接影响着谷氨酸棒状杆菌的菌体生长和菌体转型,生物素和磷酸盐的含量过多或过少都会直接影响L-谷氨酸的产量,为缓解这一问题,提出了调配磷酸盐与生物素的最适浓度配比(PV H)的策略控制发酵。为了确定发酵过程中生物素和磷酸盐的准确含量,利用单因素实验对磷酸盐与生物素的浓度配比进行调整,以找出最有利于菌体快速生长和细胞迅速转型的实验组。该实验设计生物素浓度梯度为4,10,14μg/L,磷酸盐浓度梯度为3,5 g/L,通过实验发现,当磷酸盐与生物素浓度配比为5∶14时,菌体量大,细胞转型快,产酸多,糖酸转化率高,在此条件下,最大OD 600 nm达到82,较其他组分别提高了24%、47%、50%、65%,最终的菌体量为74,较其他组分别提高了29.7%、48.6%、54%、72%,L-谷氨酸的产量为86 g/L,相较于其他组分别提高了30%、45.3%、54.6%、80%。同时,在最适PV H条件下常规发酵L-谷氨酸的实验中可以看出,其整体发酵水平高于其他非最适PV H组,该常规发酵实验中,L-谷氨酸产量高达178 g/L,转化率达到77%,对于谷氨酸发酵具有借鉴意义。

磷酸盐和pH值协同调控大肠杆菌发酵合成5-羟基色氨酸

为了提高大肠杆菌合成5-羟基色氨酸能力,该研究设计构建了pSTV28-TPH150过表达质粒,增强了羟化酶基因TPH150的表达,以HTP10为出发菌株(代谢工程实验室保藏,专利号:CN202110714155.1),电转化pSTV28-TPH150质粒得到菌株HTP10-1,发酵结果显示,存在副产物L-色氨酸积累过多,质粒不稳定等问题,因此在初始发酵工艺的基础上,通过设计4个pH梯度进行发酵对比试验和4种不同磷酸二氢钾流加策略来探究最适发酵工艺。实验结果表明,在菌株HTP10-1发酵pH值为6.7,并于发酵培养基中添加1 g/L磷酸二氢钾,葡萄糖补料瓶中添加3 g/L磷酸二氢钾时,菌体比生长速率达到最优,发酵结束后5-羟基色氨酸积累量最高达到5.46 g/L,副产物L-色氨酸积累量减少到1.37 g/L,质粒丢失率较对照组减少32%,极大地提高了菌株HTP10-1的质粒稳定性,验证了磷酸盐与发酵pH调控菌体生长的可行性,对质粒工程菌的发酵控制具有重要参考意义。