家蚕幼虫血细胞密度变化成因及血细胞密度与耐高温性的关系

【目的】血细胞是昆虫血淋巴免疫的主导者。调查家蚕Bombyx mori幼虫血细胞密度变化和成因、血细胞密度与家蚕抗性的关系,是研究家蚕血细胞相关的免疫调控和抗性育种的重要组成。【方法】用细胞计数板统计家蚕品种大造不同龄期(4龄第1-4天、5龄第1-8天和上蔟期)幼虫10μL血淋巴中的血细胞数目并计算血细胞密度,利用ImageJ软件估算横截面成像图面积来代表造血器官相对体积;用细胞计数板统计不同家蚕品种(菁松、皓月、两广二号、932、芙蓉、7532和湘辉)5龄第1天幼虫血淋巴中的血细胞数目;用qRT-PCR分析皓月和两广二号5龄第1天幼虫血淋巴中造血调控因子基因BmBCFI,BmUsh,BmGATA和BmLz的相对表达量;大肠杆菌Escherichia coli侵染大造5龄第1和3天幼虫不同时间后,用细胞计数板统计血淋巴中血细胞数目,用qRT-PCR检测血淋巴中上述造血调控因子基因的表达量;BmBCFI,BmUsh和BmLz被RNAi干扰不同时间后,qRT-PCR检测大造5龄幼虫血淋巴中靶基因的相对表达量;BmBCFI,BmUsh和BmLz被RNAi干扰48 h后大肠杆菌侵染6 h时用qRT-PCR检测大造5龄幼虫血淋巴中靶基因和免疫相关基因BmRelish,BmCactus,BmSpzl,BmPGRP-LE的相对表达量,用细胞计数板统计血淋巴中不同类型血细胞数目;35℃高温饲养12个实用家蚕品种5龄幼虫,分析血细胞数目和生存力之间的关联性。【结果】4龄期大造幼虫血细胞数目随生长逐渐上升,到5龄第1天达到顶峰,5龄第2天开始下降,直至上蔟期出现小幅升高;造血器官在5龄前中期随幼虫生长逐渐增大,5龄第6天体积达到最大,随后显著变小直至完全解离,其大小变化与血细胞数目变化时间和趋势不一致。血细胞数目多的两广二号中造血调控因子基因BmBCFI,BmUsh和BmLz的表达量均高于在血细胞数目少的皓月中,在大肠杆菌侵染后大造5龄幼虫血细胞数目达到高峰时BmBCFI,BmUsh和BmLz被显著上调表达。RNAi干扰后大肠杆菌侵染下调BmLz或BmUsh表达时,拟绛色细胞数目显著减少;而RNAi干扰后大肠杆菌侵染下调BmBCFI表达时,浆细胞数目和血细胞总数显著减少。RNAi干扰后大肠杆菌侵染下调BmBCFI或BmUsh表达时,Imd通路上BmRelish和Toll通路上BmCactus的表达量都显著下降,暗示BmBCFI和BmUsh与NF-κB信号通路激活、抗菌肽等免疫因子形成有关。不同家蚕品种间血细胞数目差异极大,有夏秋用品种的血细胞数目比春用品种高的趋势。在35℃高温饲养条件下,实用品种5龄幼虫血细胞数目与5龄幼虫死亡指数值呈负相关。【结论】家蚕造血调控因子基因的表达量影响血细胞密度,BmUsh和BmLz影响家蚕拟绛色细胞密度,BmBCFI与家蚕浆细胞形成有关。此外,BmBCFI和BmUsh可能与家蚕NF-κB信号通路激活有关,血细胞密度与高温饲养家蚕幼虫生存力呈正相关。

家蚕分泌型磷脂酶A2基因的鉴定和表达模式分析

磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)广泛分布于动物、植物和微生物,参与许多生理活动。本实验室先前鉴定和研究了1个家蚕分泌型PLA2(Bombyx mori sPLA2-1-1)基因功能。最近,从家蚕基因组鉴定到4个新的sPLA2基因(BmsPLA2-1-2、BmsPLA2-2、BmsPLA2-3、BmsPLA2-4),预测的氨基酸都具有sPLA2超家族结构域、金属离子结合位点和高度保守的催化位点等sPLA2的典型特征。本研究完成了BmsPLA2-4基因的克隆、体外表达和表达模式分析。BmsPLA2-4全长为585 bp,体外表达经Ni纯化获得重组蛋白大小约25 kDa。qRT-PCR分析表明,BmsPLA2-4在5龄第1天的表达量最高。组织表达谱分析表明,BmsPLA2-4在中肠的表达量最高,其次是体壁和脂肪体。Western blotting分析结果与qRT-PCR一致。用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染5龄第1天幼虫后,BmsPLA2-4基因的表达量在24 h显著升高。本研究为后续研究提供了理论基础和有价值的实验数据。