DC-SIGN荧光融合蛋白的构建、表达和生物学功能初探

目的构建绿色荧光蛋白(EGFP)标记的DCSIGN分子(DCSIGNEGFP融合蛋白),并在哺乳动物细胞中获得功能性表达。方法PCR方法获得DCSIGN分子和EGFP分子的cDNA,分别克隆入真核表达载体pEGFPN1和真核表达载体pCI,使EGFP荧光蛋白分别位于DCSIGN蛋白的C末端和N末端。在转染COS7细胞后,在激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测重组分子的表达及融合蛋白在细胞定位情况。激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的功能情况。结果获得了预期的重组表达质粒,经DNA测序证实开放阅读框正确,转染COS7细胞后绿色荧光蛋白位于细胞膜,仅EGFP位于DCSIGNN末端的融合蛋白可被抗DCSIGN抗体结合。EGFP位于DCSIGNN末端的融合蛋白可有效摄取DCSIGN受体的高亲和力配体le(x)寡糖。结论所构建的DCSIGNEGFP融合蛋白在细胞内表达后具有细胞表面受体分子的特征性分布,可被抗DCSIGN抗体检测及摄取特异性配体,为进一步深入研究DCSIGN分子功能提供了良好的模型。

一类C型凝集素受体DC-SIGN在免疫应答调控中的作用

DC-SIGN是一类表达在树突状细胞上的重要C型凝集素受体,能识别和捕获多种糖基化抗原,与不同的糖基化配体及病原体作用可能参与不同的免疫调控。目前,DC-SIGN在调控免疫应答中的作用被广泛的研究。本文拟主要综述DC-SIGN与不同的配体及其下传的不同信号在调控免疫应答中所起的作用。

靶向DC-SIGN的Le(x)-OVA抗原的制备

目的制备用于靶向DC-SIGN受体的Le(x)寡糖介导的靶向抗原。方法利用Su lfo-SMCC异源双功能交联试剂交联链霉亲和素(streptavid in,SA)和模式抗原卵白蛋白(ovalbum in,OVA),再利用SA与生物素高亲和力结合的特性,将SA-OVA复合物与生物素修饰的Le(x)寡糖反应,由此获得由Le(x)寡糖介导的靶向抗原Le(x)-OVA复合物。结果应用SDS-PAGE蛋白质电泳和W estern免疫印迹方法证实SA与OVA蛋白成功交联,ELISA方法证实SA-OVA复合物中的SA仍具有与生物素反应的功能,根据SA-OVA复合物与生物素修饰的Le(x)寡糖饱和反应的比例,获得所需要的靶向抗原Le(x)-OVA复合物。结论获得Le(x)寡糖介导的靶向抗原Le(x)-OVA复合物,为进一步研究经由DC-SIGN靶向后的抗原特异性免疫应答奠定了基础。

P53基因对K562细胞增殖的影响

目的 观察恢复K5 6 2细胞的p5 3蛋白功能后该细胞的生物学行为的改变 ,探索用野生型p5 3基因治疗白血病的可能性。方法 以K5 6 2细胞为研究对象 ,电穿孔法转导野生型p5 3基因 ,RT PCR和免疫细胞化学方法检测p5 3基因的表达 ,3H TdR掺入法检测细胞增殖 ,用流式细胞仪分别以TUNEL、annexin V、细胞周期检测细胞的凋亡情况和细胞周期分布情况。结果 转染p5 3基因的K5 6 2细胞 ,出现明显细胞周期G1 期停滞 ,增殖抑制率为 2 4 .17% ,但用TUNEL、annexin V和亚二倍体峰检测未发现与未转染p5 3基因组有凋亡细胞比例差异。结论 P5 3基因对K5 6 2细胞有一定的治疗效应 。

医学本科生能力培养中相关教学模式探讨

医学本科生能力培养是医科大学教育成功与否的重要方面,应该在基础医学教育阶段就受到重视。这些能力包括沟通能力、学习能力、思维能力和创新能力等。文章理性比较了各种常用的医学教学模式在医学本科生能力培养中的利弊,提出以问题为基础的教学理念讨论式教学模式会有助于医学本科生认识问题、讨论问题和在讨论中协作解决问题,从而促进医学本科生,尤其是基础医学教育阶段的医学本科生思维能力、自学能力、沟通表达能力和创新能力的提高。

KG_1及其诱导的树突样细胞中DC-SIGN的表达

目的了解在KG1诱导来源的树突样细胞(Dendritic-like cells, DLCs)中DC特异性C型凝集样受体DC-SIGN的表达.方法采用佛波酯(PMA)和离子霉素(Ionomycin)诱导KG1细胞为DLCs,采用Western免疫印迹、RT-PCR和流式细胞仪检测KG1和KG1来源的DLCs不同诱导时期DC-SIGN的表达.结果形态学方法确定成功诱导了KG1来源的DLCs,KG1细胞和其来源的DLCs均有DC-SIGN的表达,且当KG1诱导为DLCs细胞后DC-SIGN表达增强,尤其在DLCs的早期成熟阶段(诱导12～24 h).结论 KG1细胞和其来源的DLCs上均有DC-SIGN的表达,且在诱导为DLCs后DC-SIGN的表达增强,为进一步研究DC-SIGN介导的抗原呈递途径奠定了基础.

p53和淋巴系统恶性肿瘤

抑癌基因ｐ５３通过控制细胞增殖，诱导细胞凋亡来维持细胞遗传物质的稳定性，其功能失活与否成为影响肿瘤发生、发展及对放疗、化疗敏感性的关键因素。淋巴系统恶性肿瘤中存在频繁的ｐ５３基因突变，本文拟综述ｐ５３与淋巴系统恶性肿瘤的发生、发展、治疗以及预后的关系。

乙型肝炎患者HBcAg18-27表位特异性细胞毒性T细胞的研究

目的对乙肝患者尤其是慢性乙肝患者外周血HBcAg18-27表位特异性细胞毒性T细胞(CTL)的分布频率及功能状态进行研究。方法应用多色流式分析结合HLA-A*0201限制性表位肽/五聚体复合物技术对乙肝患者外周血HBcAg18-27表位特异性CTL进行精确定量,应用胞内细胞因子染色技术结合流式细胞分析技术研究HBcAg18-27表位特异性CTL穿孔素,颗粒酶B,干扰素-γ的分泌水平。结果在急性与慢性乙型肝炎患者外周血中均可测到HBcAg18-27表位特异性CTL,两者的分布频率存在显著性差异。慢性乙肝患者外周血中HBcAg18-27表位特异性CTL分泌穿孔素,颗粒酶B,干扰素的水平明显降低。结论HBcAg18-27表位特异性CTL在乙型肝炎病毒清除中起到重要作用,慢性乙肝患者外周血HBcAg18-27表位特异性CTL存在功能缺陷。

慢性乙型肝炎患者外周血中CD4^+CD25^+调节性T细胞的变化和意义

目的观察慢性乙型肝炎感染者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)的频率,特征性表型及与临床指标的相关性。方法采集44例慢性乙型肝炎,29例健康人外周血,多色流式分析Treg的频率,CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的频率。所有病例均经酶联免疫吸附实验(ELISA)检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb,实时荧光定量RT-PCR检测血清HBV DNA载量及肝功能的检测。结果慢性乙型肝炎组Treg的频率(5.02%±2.07%)显著高于正常对照组(3.35%±1.51%,P<0.05);Foxp3在Treg上特异性表达,慢性乙型肝炎组CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的频率(2.05%±1.03%)显著高于正常对照组(1.30%±0.68%,P<0.05);慢性乙型肝炎组Treg的频率与病毒载量呈正相关。结论Treg在慢性乙型肝炎感染者中明显增高,并与病毒载量相关,提示Treg在慢性乙型肝炎中担负着重要的免疫调节作用,可能是造成乙肝病毒感染慢性化的重要因素。

基于协同创新理念下的基础医学学科群建设的研究

党的十八大明确提出创新驱动发展的重大战略部署,要积极推动协同创新,建立协同创新的战略联盟,加快创新型国家建设步伐。如何加强基础医学学科协同创新,提升基础医学＂人才、学科、科研＂三位一体的创新能力,成为当下思考的重点。本文紧扣协同创新概念在新时期的意义,结合工作实践进行理论思考,探索基础医学学科协同创新模式。

酵母呈现SARS冠状病毒S蛋白受体结合区及其鉴定

目的获得能在酵母表面正确折叠的SARS病毒S蛋白的受体结合区。方法通过PCR技术从pVAX1/S质粒扩增出编码S蛋白318至520氨基酸残基的cDNA,酶切后克隆到酵母表面呈现载体pYD1,构建pYD1-RBD重组质粒,转化酵母细胞,流式细胞仪检测所呈现的RBD片段。结果通过流式细胞仪检测到酵母细胞表面有RBD片段的表达,并且此表面呈现的RBD片段与针对RBD不同表位的2株单抗均能结合,SARS病毒免疫的小鼠血清抗体也能与该片段结合。结论酵母表面呈现的RBD保持了天然RBD分子的构象,为基于RBD的药物筛选和疫苗设计提供物质基础。

应用噬菌体随机肽库技术筛选SARS-CoVS蛋白模拟表位

目的筛选SARS病毒(Severe acutere spiratorysyndromeas sociated coronavirus,SARSCoV)结构蛋白S(Spike)特异性的模拟表位,为抗SARS疫苗研究提供基础。方法以抗SARS病毒S蛋白的单克隆抗体为固相筛选分子,对人工合成的噬菌体随机12肽库进行5轮“吸附洗脱扩增”的筛选,随机挑选30个克隆,经噬菌体酶联免疫吸附(ELISA)法和交叉反应实验鉴定阳性克隆,再进行DNA序列分析和竞争抑制结合实验,以确定SARS病毒S蛋白的模拟表位。结果经噬菌体富集后,从随机挑选的30个克隆中得到了29个编码8种12肽的阳性克隆,8条肽与S蛋白的320～350氨基酸序列有较高同源性,确定YF、W、E和K氨基酸残基为模拟表位的骨架结构。结论用噬菌体12肽库成功筛选到了SARS病毒S蛋白的模拟表位,为基于S蛋白的肽疫苗研制提供了基础。

人源轮状病毒的小型猪腹泻模型建立

目的建立人源轮状病毒的小型猪腹泻模型，为人源轮状病毒感染的免疫保护机制、致病机制及疫苗的研制奠定基础。方法ELISA与RT-PCR相结合分离鉴定野生型人源轮状病毒；用野生型人源轮状病毒G1与G3血清型口服接种不同日龄的小型猪，观察粪便排泄等临床症状，ELISA及免疫荧光分别检测粪便与小肠上皮组织中的轮状病毒抗原，光镜及透射电镜观察小肠上皮组织的病理变化与病毒样颗粒。结果3～5日龄小型猪均出现了典型的临床腹泻症状；粪便中轮状病毒抗原排泄可平均持续5～7d；小肠组织可见明显的病理变化，同时用免疫荧光检测方法可在小肠组织中检测到特异性轮状病毒抗原；透射电镜进行观察，在小肠组织的超薄切片中可见到大量的轮状病毒颗粒。30～35日龄小型猪可出现明显腹泻临床症状，粪便中轮状病毒抗原排泄可持续4～7d；56～60日龄小型猪接种野生型人源轮状病毒G1血清型后，均未出现典型的腹泻症状，但可持续排毒2～3d。结论小型猪可作为人源轮状病毒的理想腹泻动物模型。

小型猪外周血单个核细胞产生IFN-γ频率年龄依赖性初探

目的通过检测不同日龄小型猪外周血单个核细胞产生IFN-γ的频率,初步探讨小型猪免疫细胞功能的发育时限。方法分别取3日龄、2月龄、6月龄、1周岁及2周岁小型猪的外周血,提取单个核细胞,进行胞内细胞因子IFN-γ染色,流式细胞仪检测不同日龄小型猪外周血单个核细胞产生IFN-γ的频率。结果3日龄、2月龄、6月龄1、周岁及2周岁小型猪的外周血单个核细胞产生IFN-γ的频率分别为2.73%、3.80%、10.00%、38.09%及41.03%。结论小型猪免疫细胞功能具有明显的发育时限。1周岁以上小型猪的免疫细胞功能发育基本成熟。

轮状病毒结构蛋白VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位的初步鉴定

目的预测并初步鉴定轮状病毒W a株结构蛋白VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位,为轮状病毒免疫保护机制研究及疫苗的研制奠定基础。方法应用表位亲和力预测软件SYFPEITH I及蛋白酶切位点预测软件PAProc和Fragpred ict相结合预测VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位;用分子模拟对候选肽作进一步筛选;标准Fmoc方案合成候选肽,RP-HPLC纯化、分析,质谱进行鉴定;最后用T2细胞株测定候选肽与HLA-A*0201分子的亲和力及稳定性。结果结合SYFPEITH I、蛋白酶切位点预测结果及分子模建结果,选择分值最高同时在C末-端含有蛋白酶切位点的4条肽作为候选表位肽;标准Fmoc方案合成的各肽纯度均大于95%,质谱检测结果表明,各肽的相对分子质量与理论值基本一致;在候选的4条表位肽中,TLLANVTAV(340-348)和VLADANETL(333-341)与HLA-A*0201呈高亲和力结合,荧光系数(flu-rorescene index,FI)分别为2.66和2.64,同时肽-HLA-A*0201复合物半数解离时间(d issoc iation comp lex50,DC50)均大于8 h。结论TLLANVTAV(340-348)和VLADANETL(333-341)为潜在的HLA-A*0201限制性CTL表位。

轮状病毒结构蛋白VP7 HLA-A2.1限制性CTL表位的初步鉴定

目的 预测并初步鉴定轮状病毒Wa株结构蛋白VP7 HLA—A2．1限制性CTL表位。方法 用BIMAS软件预测VP7 HLA—A2．1限制性CTL表位；分子模拟技术对分值最高的4条肽进行分子模建；最后测定候选肽与HLA-A2．1分子的亲和力及结合稳定性。结果 结合BIMAS及分子模拟的预测结果，选择4条肽QLYCDYNLV（132—140）、LLNYILKSV（18—26）、VLMKYDQSL（140—148）及VNWKKWWQV（287—295）作为候选表位肽；4条肽与HLA—A2．1结合的荧光系数（FI）值分别为2．58、3．83、3．19及0．82，肽-HLA-A2．1复合物半数解离时间（DC50）分别为2-4、6-8、8及2h。结论 QLYCDYNLV（132—140）、LLNYILKSV（18—26）及VLMKYDQSL（140—148）为潜在的HLA-A2．1限制性CTL表位。

临床医学专业医学免疫学多媒体教学体会

医学免疫学是一门与多学科广泛交叉、内容抽象、理论体系极为复杂的医学基础学科。结合多年的教学经验,就如何充分利用多媒体教学手段的优势激发临床医学专业学生的学习兴趣、提高学生综合素质与教学质量谈几点体会。

Lewis^x五糖的有效合成:发展DC-靶向疫苗的有效分子

将选择性保护的乳糖二醇与Lewisx三糖在N-碘代丁二酰亚胺(NIS)/TfOH催化下高立体、高区域选择性糖苷化得Lewisx五糖,后者脱保护后获得目标五糖,总收率67.7%.化合物结构经NMR,MS和元素分析确证.

肝细胞内NLRP3炎症体的表达与炎症应答初步研究

目的探讨炎症体(inflammasome)在肝细胞内的表达,明确肝细胞内炎症体是否具有正常的炎症应答功能。方法以肝细胞株L02、HepG2为研究模型,RT-PCR、Real-time PCR检测LPS刺激及未刺激组caspase-1、IL-1β的mRNA的表达水平;Western blot检测NLRP3的表达和各刺激组胞内caspase-1活化;ELISA检测各刺激组上清中IL-1β和IL-18的分泌。结果 L02、HepG2细胞均表达NLRP3炎症体,LPS刺激促进肝细胞内caspase-1、IL-1β表达上调;内源性危险信号ATP能有效活化肝细胞内caspase-1酶原,促进IL-1β和IL-18分泌增加,caspase-1特异性抑制剂能特异性的抑制IL-1β、IL-18的分泌。结论肝实质细胞的NLRP3炎症体对内源性危险信号具有炎症应答功能,在肝内无菌性炎症的启动和维持中可能具有重要促进作用。