牛结节性皮肤病病毒检测及蠓、蚊携带病毒调查

【目的】了解牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)在自然感染状况下病牛的带毒状况及其潜在的传播媒介种类,为牛结节性皮肤病防控提供参考依据。【方法】于2021年7月在云南省文山市采集疑似发病牛不同组织类型标本,2020年8月和2021年7月~2021年8月分别在云南省昆明市、文山市和双江县采集疑似LSDV感染的牛圈舍蠓、蚊标本,并进行形态学鉴定。采用实时荧光定量PCR方法检测发病牛不同组织及库蠓、库蚊标本中LSDV核酸;采用LSDV127基因特异引物对皮肤结节标本进行PCR扩增及测序;利用DNAStar和Mega 6.0等软件进行核苷酸序列相似性比对和系统进化分析。【结果】3头发病牛全血、血清、鼻拭子和皮肤结节标本中均检测到LSDV核酸,且皮肤结节标本中LSDV核酸扩增曲线信号最强;LSDV127基因序列分析结果显示,3份皮肤结节标本(17、18和19)的病毒核苷酸序列相似性为100%,与俄罗斯、泰国、越南和南非等LSDV分离株聚为一支,亲缘关系较近,核苷酸序列相似性在99.7%~100%之间。共采集鉴定条带库蠓、连斑库蠓和尖喙库蠓3种,库蠓标本4822只,库蚊标本150只。所有采集自发病牛圈舍的库蠓和库蚊标本LSDV核酸检测结果均为阴性。【结论】在自然感染LSDV的牛中,血液、鼻分泌物和皮肤结节等不同部位都可能为节肢动物媒介获得并传播LSDV提供很好的感染源;蠓、蚊等节肢动物媒介是否参与了当地LSDV的传播有必要进一步调查。

云南登革4型病毒的鉴定及NS1和NS2a基因序列分析

目的对1989年8月分离自云南省盈江县蚊虫的2株登革病毒进行生物学及分子特征的鉴定,明确这两株病毒的血清型及基因型。方法蚊虫用BHK21细胞和乳鼠法分离病毒,用间接免疫荧光试验、RT-PCR等方法进行鉴定,并对这两株病毒的分子生物学特征进行分析。结果从白纹伊蚊和达勒姆阿蚊中各分离到一株病毒,分别命名为M110和M113,这两株病毒对BHK21细胞能产生明显的细胞病变,脑内接种乳鼠4d左右导致乳鼠死亡。该病毒经血凝、血凝抑制和间接免疫荧光试验提示为黄病毒。分别用黄病毒属特异引物、登革4型病毒NS1和NS2a基因片段特异引物进行RT-PCR扩增、序列测定,证实为登革4型病毒。NS1和NS2a基因序列片段分析表明,M110和M113的NS1核苷酸序列与登革4型病毒基因Ⅰ型的H241株(Y19176)同源性最高,分别为99%、98%;NS2a基因片段与H241的核苷酸序列的同源性分别为96.5%、97.1%。结论从盈江县蚊虫分离到的M110和M113病毒为登革4型病毒基因Ⅰ型,表明云南省西部边境地区在20世纪80年代发生过登革4型病毒的流行。

首次从云南蚊虫分离到辛德毕斯病毒及其鉴定

目的了解云南省虫媒病毒的存在和流行情况。方法2005年8月,在云南省勐海县采集蚊虫,蚊虫标本经研磨后,上清液接种BHK21细胞以分离病毒,用间接免疫荧光试验和RT-PCR等方法进行鉴定,并对病毒的分子生物学特征进行分析。结果采集到蚊虫标本9400只,其中分离到一株对BHK-21细胞能产生明显细胞病变的病毒(MX10)。该病毒经间接免疫荧光试验提示为甲病毒。用甲病毒属特异引物和Sindbis病毒E1基因特异引物对MX10病毒的RT-PCR扩增为阳性,经核酸序列测定分析证实该序列与Sindbis病毒泰国分离株(AF492770)同源性最高,为90.0%;与1987年分离自云南发热患者的YN87448株和1991年新疆按蚊分离株XJ-160的同源性分别为73.1%和72.0%。结论本次从勐海县蚊虫分离到的MX10病毒株为Sindbis病毒,并可能是Sindbis病毒的新亚型或新株系。

首次从我国大绒鼠中检测到类似Tula样汉坦病毒

目的了解云南省鼠类携带汉坦病毒情况及其分子特征。方法在居民区和野外捕鼠,用直接免疫荧光试验检测鼠肺中汉坦病毒抗原,阳性鼠肺用RT-PCR法扩增汉坦病毒汉滩型和汉城型的S基因片段,并进行核苷酸序列测定和分析。结果 2006年9-10月在云南省泸西县共捕获鼠类4属6种267只,其中居民区146只,优势鼠种为黄胸鼠;野外121只,优势种为大绒鼠。居民区鼠类汉坦病毒带病毒率为0.85%(1/117),阳性鼠为黄胸鼠;野外鼠类汉坦病毒带病毒率为6.67%(6/90),阳性鼠为大绒鼠和高山姬鼠。对7份阳性鼠肺作RT-PCR扩增,结果从来自大绒鼠的LX378标本中检测到汉滩型病毒S片段核酸,其序列分析结果显示与Tula汉坦病毒Koziky/5276Ma/94株(AJ223601)核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为81%、89.8%,而与汉滩型76-118株、汉城型L99株的核苷酸(氨基酸)同源性分别为73.9%(80.9%)、74.4%(77.9%)。结论首次从我国大绒鼠中检测到类似Tula样汉坦病毒的核酸序列,有关该类汉坦病毒在云南的分布、宿主动物和致病性以及全基因序列特征尚需进一步研究。

母鼠混配农药暴露对仔鼠大脑NMDA受体亚单位NR1表达的影响

[目的]探讨母鼠暴露甲基对硫磷与氯氰菊酯混配农药对仔鼠大脑NMDA受体亚单位NR1表达的影响。[方法]将48只妊娠Wistar大鼠随机分为高、中、低3个剂量组和1个对照组,于妊娠第1～15天用甲基对硫磷与氯氰菊酯等毒性混配液进行连续灌胃染毒,剂量分别为1/30 LD_(50)、1/95 LD_(50)、1/300 LD_(50),对照组采用食用油灌胃。在仔鼠出生后7、14、21、28天龄时分别从各组中随机抽取5只,共80只动物作为观察对象。采用免疫组化方法测定大脑皮质内侧、皮质外侧、梨状皮质、中脑黑质网状结构、海马(CA1、CA3、DG区)的NR1受体表达。[结果]在大脑皮质外侧,中、高剂量组21、28天龄仔鼠的NR1受体蛋白表达比对照组降低(P<0.05)。在中脑高剂量组21天龄仔鼠的NR1受体表达高于对照组(P<0.05)。在海马CA1区,高剂量组14天龄仔鼠NR1受体的表达低干低剂量组(P<0.01),高剂量组21天龄仔鼠则低于对照组和低剂量组(P<0.01);随着该混配农药剂量水平的升高,NR1受体蛋白表达显著下降,具有剂量-效应关系(r=-0.377,P<0.01)。海马CA3区低剂量组14天龄仔鼠的NR1受体阳性细胞表达数高于对照组(P<0.05),其他部位的NR1受体蛋白表达无改变(P>0.05)。[结论]母鼠甲基对硫磷和氯氰菊酯混配农药暴露可干扰仔鼠脑NR1受体的正常表达过程,使大脑部分区域NR1受体表达下调,延迟受体蛋白的表达高峰。

出生前氯氰菊酯与甲基对硫磷暴露对大鼠脑细胞DNA损伤的探讨

目的 探讨大鼠出生前暴露于农药氯氰菊酯和甲基对硫磷混配对胎鼠和子鼠脑细胞DNA的毒性效应。方法48只Wistar大鼠在怀孕第1～15天每日一次采用甲基对硫磷、氯氰菊酯混配农药灌胃，1个对照组和3个暴露组，剂量分别为0、（0．0230＋0．8000）、（0．0725＋2．5265）和（0.2300＋8．0000）／mg／kg bw，相当于（0、1／300、1／95和1／30）LD50。分别取24只孕16天胎鼠大脑和24只出生后30天龄子鼠大脑，采用单细胞凝胶电泳技术分析脑细胞DNA的损伤。结果甲基对硫磷和氯氰菊酯混配在中、高剂量水平可明显引起妊娠16天胎鼠脑细胞DNA的断裂（P〈0．05），并存在明显的剂量-反应关系（r=0．836，P=0．000）。在高剂量水平可引起出生后30天子鼠脑细胞DNA损伤的断裂（P〈0．05）；子鼠脑细胞DNA损伤程度比胎鼠减轻（F=15．81，P〈0．05）。结论大鼠出生前暴露于甲基对硫磷和氯氰菊酯混配可引起神经细胞DNA链断裂损伤，呈现剂量-反应关系，在较低剂量水平DNA损伤能够被修复，而在较高剂量水平DNA损伤不能够被修复。

云南省辛德毕斯病毒血清流行病学调查

采用血凝抑制试验 (HI)检测了 1998年采集的云南省 31个县市 1847份健康人血清中的辛德毕斯 (Sindbis)病毒抗体 ,阳性 35 6份 ,总阳性率为 19.2 7% ;其中健康人阳性率为 2 0 .71% (334 / 16 13) ,儿童阳性率为 1.33% (2 / 15 0 ) ,放牧人员阳性率为 49.0 3% (76 / 15 5 ) ,士兵阳性率为 2 .38% ,发热病人阳性率为 13.33% (2 0 / 15 0 ) ;不同县市抗体阳性率之间有显著差异 ,以滇西南及金沙江河谷地带较其它地区高 ,抗体阳性率与海拨、气温。

云南省褐家鼠与黄胸鼠中汉坦病毒的流行病学研究

目的 研究云南省褐家鼠、黄胸鼠中汉坦病毒的感染情况及其型别，以明确基因亚型及其地理分布，为该地区肾综合征出血热（HFRS）的预防控制提供科学依据。方法 捕捉鼠类取鼠肺，冷冻切片后以间接免疫荧光法检测鼠肺中汉坦病毒抗原，从阳性鼠肺标本中提取病毒RNA，利用RT—PCR扩增汉坦病毒S和M基因部分片段并测序分型，构建系统发生树进行系统发生分析。结果 共捕获褐家鼠和黄胸鼠307只，检测到阳性样品14份，阳性检出率为4．56％。分析部分S片段（600～999nt）与M片段G1区（140～640nt）、G2区（2003～2302nt）的核苷酸序列，及用部分S及G2核苷酸序列构建的系统发生树，将来自云南省8个地区的汉城病毒分为2个亚型：S1和S3亚型。结论 云南省主要为家鼠型HFRS疫区，汉城病毒有2个亚型，地理分布较广。

云南省大理市鼠、蜱中检测出斑点热群立克次体DNA

目的 了解鼠、蜱中自然感染斑点热群立克次体状况。方法 用PCR法检测鼠类脾脏和蜱类中的斑点热群立克次体DNA序列片段。结果 在云南省大理市下关野外山地捕获鼠类 9种 5 1只 ,从大足鼠 (1/ 15 )、大绒鼠 (1/ 7)和短尾 (1/ 8)各检出阳性 1份 ,其他鼠种均为阴性 ,总阳性率为 5 .88%。从采自弥渡县的 2 0 8只勐突血蜱中检出阳性 5份 ,阳性率为 2 .40 %。结论 初步认为云南省大理地区存在斑点热疫源地。

云南蝙蝠血液乙型脑炎病毒分离物的研究

目的 :进一步探索蝙蝠在乙脑病毒贮存宿主方面的作用。方法 :病毒分离、微量血凝抑制试验 (HI)、间接免疫荧光试验 (IFAT)、电镜和病理检查。结果 :从蝙蝠血中分离到两株乙脑病毒。结论 :蝙蝠在乙脑病毒在自然界中的贮存和扩散方面具有重要的流行病学意义。

蝙蝠作为流行性乙型脑炎病毒宿主的研究

于 1 98 6、1 988、1 990和 1 997年的 7-8月 ,在云南省共捕获 653只蝙蝠 ,其中棕果蝠( Rousettus leschenaulti) 593只 ,金管鼻蝠( Murina aurata) 60只 ,采集血清及剖取脑组织作病毒分离和抗体检查。用细胞法和乳鼠法分离到 6株病毒 ,带毒率为 0 .96% ,其中从捕自景洪的棕果蝠脑组织中分离到 3株 ,从河口的棕果蝠血清中分离到 2株 ,从捕自耿马的金管鼻蝠脑组织中分离出 1株。棕果蝠和金管鼻蝠的带毒率分别为 0 .84%和 1 .67%。这 6株病毒能引起 C6/ 3 6和 BHK2 1细胞病变和导致乳小白鼠或 3～ 4周龄小白鼠发病和死亡 ,并具有典型的嗜神经病毒感染症状。经血凝抑制、补体结合、免疫荧光和中和试验鉴定 ,新分离的 6株病毒均为乙脑病毒 ( JE virus)。同期用血凝抑制试验对采获的 42 5份棕果蝠血清作乙脑病毒抗体检查 ,阳性 1 53份 ,阳性率为 3 6% ,具有较高的感染率。本次从棕果蝠和金管鼻蝠体内分离出乙脑病毒属具有重要流行病学意义。

出生前暴露甲基对硫磷与氯氰菊酯混配农药对大鼠子代神经行为毒性的影响

[目的]探讨出生前甲基对硫磷与氯氰菊酯混配染毒,对大鼠子代神经行为发育的影响。[方法]48只Wistar孕鼠随机分为4组,于妊娠第1～15天用农药甲基对硫磷与氯氰菊酯进行连续灌胃染毒,对照组采用溶剂灌胃。甲基对硫磷剂量分别为:0,0.0230,0.0725,0.2300mg/kg体重;氯氰菊酯剂量分别为0,0.8000,2.5265,8.0000mg/kg体重。甲基对硫磷与氯氰菊酯采用等毒性混配,即分别为:0、1/300LD50、1/95LD50、1/30LD50,对349只仔鼠进行早期神经行为发育指标的测试;对64只仔鼠进行Morris水迷宫空间学习和记忆能力的测试。[结果]仔鼠断崖回避达标率在出生的第5、6天,高、中剂量组低于对照组(P<0.05);视觉定位达标率在出生的第16天下午,高、低剂量组低于对照组(P<0.05)。Morris水迷宫实验测试指标,各剂量组与对照组差别无显著性(P>0.05)。[结论]大鼠孕期暴露于甲基对硫磷与氯氰菊酯混配农药,对仔鼠的神经行为发育可产生一定的影响。

从云南省蝙蝠脑组织中分离出乙型脑炎病毒

为进一步阐明蝙蝠在保存乙脑病毒中的作用 ,于 1997年 7月 ,在云南省耿马县捕捉蝙蝠 6 4只 ,取脑组织作病毒分离 ,从一只金管鼻蝠脑组织中分离出 1株病毒。该毒株能引起BHK2 1细胞病变和乳鼠发病死亡 ,在 pH5 75～7 4时能凝集鸽红血球 ,经用单克隆抗体血凝抑制和免疫荧光试验鉴定 ,证实为乙型脑炎病毒。进一步证明蝙蝠在乙型脑炎病毒保存和扩散中具有重要作用。

云南省新分离蚊浓核病毒的分子特征研究

对云南省新分离的14株浓核病毒进行基因序列测定和分析,以了解浓核病毒基因组结构及特性.用浓核病毒基因组扩增引物（DNV3F,DNV3R）,RT-PCR扩增片段,PCR产物直接测序,拼接后获得基因序列.通过Clustal X（1.8）、DNAStar、GeneDoc （3.2） 等生物学软件进行核苷酸序列及氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析.结果表明,2007年7～8月,在云南省西部中缅边境地区采获蚊虫4属29种54 673只,分离到14株浓核病毒,其中来自三带喙库蚊Culex tritaeniorhynchus 10株,中华按蚊Anopheles sinensis、伪杂鳞库蚊Culex pseudovishnui、环带库蚊Culex annulus和致倦库蚊Culex pipiens quinquefasciatus各1株.新分离株与我国其他省市的分离株核苷酸同源性很高,在99.9%～100%之间;氨基酸同源性在99.7%～100%之间.基于NS1和NS2基因进行进化分析显示,云南新分离的14株浓核病毒与以往中国分离株进化关系最接近.

云南省2006年肾综合征出血热监测研究

目的了解云南省肾综合征出血热流行病学特点,提供科学的防治依据。方法收集全省2006年疫情资料,并在监测点采集人血清及鼠肺和鼠血清作汉坦病毒抗原和抗体检查。结果2006年全省共报告本病39例,死亡1例,年发病率为0.05/10万,病死率为2.56%。主要发病地区为大理州、昆明市和红河州。疫区人群隐性感染率为6.90%。2006年在泸西、寻甸和永胜监测点捕获鼠类10种810只,居民区以褐家鼠和黄胸鼠为优势鼠种,野外以高山姬鼠、中华姬鼠和大绒鼠为优势鼠种。鼠间汉坦病毒带毒率为4.13%,带病毒鼠种为褐家鼠、黄胸鼠、高山姬鼠、中华姬鼠和大绒鼠。结论监测区内存在以褐家鼠和黄胸鼠为主要宿主的家鼠型疫源地,也存在着以高山姬鼠、中华姬鼠和大绒鼠为主的野鼠型疫源地。应采取以灭鼠和接种家鼠型或两型混合疫苗为主的防治措施。

妊娠期混配农药暴露对亲子两代大鼠内分泌和免疫系统的影响

[目的]探讨妊娠期氯氰菊酯和甲基对硫磷混配染毒对亲子两代大鼠的内分泌干扰和免疫毒性效应。[方法]孕鼠112只随机均分为4组,于妊娠第1～15天,以剂量为0(对照组)、1/300LD5(0低)、1/95LD5(0中)、1/30LD5(0高)等毒混配的氯氰菊酯和甲基对硫磷,每日灌胃染毒1次,共15天;对照组为色拉油。56只孕鼠自然分娩,仔鼠10周龄时随机抽取64只(每组16只,雌雄各半)处死;另56只孕鼠(每组14只)于妊娠19天处死;亲子两代分别称量脏器重量,用放射免疫法测定血清促卵泡成熟激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)、雌二醇(E2)和睾酮(T);三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)和促甲状腺激素(TSH)以及免疫球蛋白IgG和IgA。[结果]脏器系数中仅仔鼠的卵巢重量系数与混配农药之间存在剂量-效应关系(rs=0.3144,P=0.0172);孕鼠中剂量组血清T3水平高于对照组(P<0.05),仔鼠低剂量组血清睾酮高于对照组(P<0.05);孕鼠IgA水平存在剂量-效应关系(rs=0.4649,P=0.0002);其余未发现异常。[结论]妊娠期氯氰菊酯和甲基对硫磷混配染毒对母鼠和子代有一定的内分泌干扰效应。

云南省澜沧江下游地区人及动物血清虫媒病毒抗体调查

目的 :对澜沧江下游地区的思茅和西双版纳两地州进行虫媒病毒抗体调查 ,了解当地虫媒病毒的流行情况。方法 :采集人及动物血清 ,用ELISA和血凝抑制试验检测抗体。结果 :发热病人血清中 ,乙型脑炎 (JE)、登革 3型 (DEN3)、DEN4、基孔肯雅 (CHIK)、辛德毕斯 (SIN)、贝巴鲁 (BEB)、雪鞋野兔 (SSH)和巴泰 (BAT)病毒抗体的阳性率依次为 7.5 0 %、5 .0 0 %、1.6 7%、3.33%、2 .5 0 %、1.6 7%、5 .0 0 %和 4 .17% ;未查到DEN1、DEN2和寨卡 (Zika)病毒抗体。正常人血清JE、墨累山谷脑炎 (MVE)、库京 (KUN)、DEN、圣路易脑炎 (SLE)、科萨努尔森林病 (KFD)、森林脑炎 (RSSE)、兰加特 (LAG)、波瓦生 (POW )、马雅罗 (MAY)、CHIK、SIN、委内瑞拉马脑炎 (VEE)、西门利克森林病(SFD)和格塔 (GET)病毒抗体阳性率依次为 34.88%、、35 .0 3%、2 0 .81%、9.2 5 %、1.78%、12 .4 6 %、4 .76 %、2 .85 %、2 .4 9%、2 1.71%、11.0 3%、1.93%、2 .4 9%、2 .4 9%、3.2 0 %。从恒河猴血清中检出DEN、KUN、RSSE、KFD、POW、LAG、CHIK和GET病毒抗体 ,阳性率以DEN4、KUN和RSSE为高。棕果蝠血清中查到JE、DEN4、RSSE、POW和LAG病毒抗体 ,JE的阳性率最高。猪血清中查到JE、DEN和CHIK抗体。黄胸鼠血清检出JE、KFD、CHIK和SIN病毒抗体 ,

云南辛德毕斯病毒的生物学性状研究

本文对云南首次分离到的Sindbis病毒进行了滤过试验、耐酸耐醚试验、致细胞病变、动物敏感性试验、血凝特性、空斑和毒力等试验研究 ,结果符合披膜病毒科的病毒特性。交叉血抑试验和免疫荧光试验 ,以及空斑减少中和试验进一步证实为甲病毒属的Sindbis病毒。其空斑纯化株的生物学特性也与原株相符 ,纯化株的制备为该株病毒分子生物学研究的准确性和一致性提供了条件。云南Sindbis病毒的首次分离具有重要的流行病学意义 ,其生物学特性研究结果对我省该病的诊断和防治具有重要的指导意义。

云南大理地区恙虫病血清学诊断及病原体基因序列分析

目的对云南大理地区恙虫病做血清学诊断及病原体基因序列分析。方法采用间接免疫荧光方法(IFA)检测不明原因发热患者血清中的恙虫病东方体(Ot)IgG抗体,用巢式PCR(nPCR)法扩增患者血液中的Ot groEL与sta56基因并对扩增基因做序列分析。结果 19例不明原因发热病例中恙虫病患者8例,其中血清Karp型4例、Kato型3例、Karp和Kato混合型1例;3例确认恙虫病的血样本扩增到groEL基因片段,其序列同源性为100%,基因序列做系统进化树显示该Ot与Karp和Kato株在同一分支上。从Karp和Kato混合血清型病例血样本扩得sta56基因片断,序列分析显示该Ot与台湾分离株在同一分支上。结论这些云南大理的恙虫病患者由恙虫病东方体Karp或Kato血清型感染;个别患者可能Karp+Kato混合血清型感染,Karp+Kato混合血清型菌株可能在遗传进化上与某些台湾Ot株关系密切。