iTRAQ技术鉴定小鼠睾丸发育差异表达蛋白的研究

目的用同量异位素标记的相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术结合液相色谱质谱技术构建3周龄小鼠与成年小鼠睾丸蛋白差异表达谱系。方法分别抽提3周龄小鼠与成年小鼠睾丸总蛋白质,iTRAQ标记,液相色谱(LC)分离蛋白质,LTQ OrbitrapTM质谱仪进行蛋白质鉴定。结果鉴定出20个差异表达蛋白质,其中18个为3周龄小鼠睾丸高表达蛋白质,2个为成年睾丸高表达蛋白质。差异表达蛋白质主要参与细胞的有丝分裂、减数分裂、细胞增殖、分化、凋亡及精子发生等重要细胞事件。结论用目前最新的定量蛋白质组技术,构建的3周龄小鼠睾丸与成年睾丸差异表达蛋白谱系对研究睾丸功能、精子发生有一定理论价值,为定量蛋白组学技术在雄性生殖领域的应用奠定了基础。

小鼠spindlin1蛋白在稳定MII期卵母细胞纺锤体中的作用

目的目的探讨小鼠spindlin1蛋白在MII期卵母细胞中的作用。方法采用免疫荧光方法对spindlin1蛋白在小鼠卵母细胞中的定位进行研究。采用抗体显微注射实验对其在MII期卵母细胞中的功能进行了研究。结果免疫荧光结果显示在MII期,spindlin1蛋白定位于中期纺锤体,当卵母细胞进入分裂后期,spindlin1蛋白从纺锤体上消失。抗体注射实验显示在MII期卵母细胞中干扰spindlin1蛋白后,纺锤体形态明显异常且染色体排列发生紊乱。结论小鼠spin-dlin1蛋白在MII期卵母细胞中发挥作用,参与维持中期纺锤体的稳定,保障了染色体的正确分离。

无标记定量方法在小鼠精子发生相关蛋白质组学研究中的应用

目的:利用无标记定量蛋白质组学技术筛选在3周龄及成年小鼠睾丸中差异表达的蛋白质。方法:分别抽提3周龄及成年小鼠睾丸蛋白,酶解后所得肽段经纳升液相色谱分离,并经LTQ Obitrap质谱鉴定,在获得蛋白鉴定信息的同时根据相应肽段离子质谱峰强度对蛋白进行相对定量。结果:在3周龄及成年小鼠睾丸中共鉴定到非冗余蛋白319种,其中30种蛋白在两者之间存在显著的表达差异,这些蛋白主要参与形态发生、收缩、胞吞、受精等细胞事件,与精子变形过程及精子功能相关。结论:无标记定量蛋白质组学技术,具有方法简便、通量大、成本低廉等优点,利用其寻找睾丸发育,精子发生/功能相关蛋白具有广阔的前景。

精子发生中Alu序列的返座作用

目的 :克隆人类精原细胞和初级精母细胞特异表达的基因。 方法 :应用改良的mRNA表达图谱分析技术 ,对正常男性、唯支持细胞综合征和生精阻滞在初级精母细胞病人的睾丸进行mRNA表达图谱分析的差异显示 ,选择唯支持细胞综合征缺失的表达基因并克隆测序。 结果 :正常男性、唯支持细胞综合征和生精阻滞在初级精母细胞症病人的睾丸组织表达图谱存在显著的表达差异 ,目前已获得唯支持细胞综合征缺失的片段 88个。在已分析的 6个片段中 ,1个与人类的Alu序列家族 (Alufamily) 98%同源。 结论 :Alu序列在生精细胞中通过返座作用形成新Alu序列 。

人精子抗原基因－2表达产物相关抗体对精子运动的影响

在构建成人睾丸ｃＤＮＡ文库的基础上，用兔抗人精子抗体自文库中筛选出了８株阳性克隆，并对其中的ＨＳＧ２表达产物进行理化特性测定和抗ＨＳＧ２表达产物抗体的生物学活性测定。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示溶原蛋白的分子量约为１５５ＫＤａ。抗ＨＳＧ２表达产物抗体能明显的抑制精子的运动能力，对精子凝聚、顶体蛋白酶和精子表面的ＣｏｎＡ受体无影响。提示ＨＳＧ２表达产物可能成为精子疫苗的候选成份。

精子发生相关基因DYS1的分析

用ＰＣＲ方法检测了核型正常（４６，ＸＹ）的９５例无精子症患者和３５例严重少精子症患者基因组ＤＮＡ中的ＤＹＳ１，发现４例无精子症患者有ＤＹＳ１的丢失，严重少精子患者中发现３例有ＤＹＳ１的丢失。结果表明：应用ＰＣＲ法检测ＤＹＳ１基因片段是切实可行的，对无精子症和严重少精子症患者的病因诊断具有一定的应用价值。

DAZ及DAZH基因与精子发生的相关性分析

ＤＡＺ基因（ｄｅｌｅｔｅｄｉｎａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ）是无精子因子（ＡＺＦ）的重要候选成分，它的缺失可致无精子或严重少精子症。人第３号染色体上存在着ＤＡＺ的同源基因ＤＡＺＨ（ＤＡＺｈｏｍｏｌｏｇｕｅ），为探讨ＤＡＺ和ＤＡＺＨ基因在精子发生中的作用，我们用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法检测了６６名正常生育男性和９０例原发性不育男性基因组ＤＮＡ的ＤＡＺ、ＤＡＺＨ基因。结果：原发性不育男性中１２例ＤＡＺ缺失（无精子症８例，严重少精子症４例）；正常男性ＤＡＺ无一缺失；在正常男性和不育男性中均有ＤＡＺＨ缺失。结果进一步证实ＤＡＺ为ＡＺＦ的候选成分，而ＤＡＺＨ基因与精子发生似无直接的相关性。

HSG2表达精子抗原在抗精子抗体检测中的应用

ＨＳＧ２表达精子抗原在抗精子抗体检测中的应用周作民，沙家豪，胡志刚，王黎熔，林敏（南京医科大学组胚教研室，南京，２１００２９）抗精子抗体的研究对于免疫性不孕症的诊治和免应避孕疫苗的研究有着极其重要的意义。这一研究的首要前提是建立一个灵敏、准确的抗体检...

染色体1;12平衡易位与精子发生相关性研究

目的 :对发现的不育伴染色体 1;12平衡易位的孪生兄弟进行研究 ,探讨与精子发生的关系。 方法 :对孪生兄弟进行染色体核型、精液常规、外周血激素测定和睾丸病理分析 ,并进行精子发生相关基因YRRM1、DAZ和DYS2 4 0位点的测定。 结果 :孪生兄弟的染色体核型均为 4 6 ,XY ,t(1;12 ) (q2 4 ;q2 4 ) ;精子密度 <1 0× 10 6/ml;外周血睾酮略低于正常 ,FSH和LH均正常 ;Y染色体长臂上的YRRM1、DAZ和DYS2 4 0基因未见缺失 ;睾丸病理分析显示生精阻滞 ,偶见精子。 结论 :染色体平衡易位t(1;12 ) (q2 4 ;q2 4 )可能是孪生兄弟精子发生障碍的原因 。

mRNA差异显示法克隆小鼠精子发生相关基因-p38MAPK基因

目的 克隆 1、2、3、4周龄小鼠睾丸之间差异表达的基因。 方法 应用改良的mRNA差异显示技术 ,对 1、2、3、4周龄小鼠睾丸进行了基因表达的差异显示分析 ,并对其中 1个从 2周龄小鼠中高表达的cDNA片段进行了克隆和测序。 结果 所克隆的cDNA片段与小鼠大脑、造血干细胞p38MAPK(p38betamitogen activatedpro teinkinase ,p38MAPK β)基因的同源性分别为 91%和 85 %。Northerndotblot结果显示该基因在小鼠睾丸和脑组织中表达最高。

男性不育症患者精液细胞成分DNA流式细胞术分析

目的 研究男性不育症患者精液细胞DNA的病理改变。 方法 采用流式细胞仪 (FCM)、激光共聚焦显微镜 (CLSM)和常规精液检查法 ,对 82例男性不育症患者进行精液细胞DNA分析。 结果 男性不育症患者精液细胞成分等有多种变化 :1.亚单倍体细胞碎片和凋亡细胞增多。 2 .单倍体的成熟精子数量减少。 3.单倍体圆形精子细胞增多。 4.畸形精子增多 ,精子DNA含量和密度异常。 5 .≥ 2倍体的细胞 (白细胞、G1 期精原细胞、精母细胞、上皮细胞及 4倍体细胞等 )增多。 6 .少精和无精。 结论 精液细胞DNA变化反映男性不育症患者精液细胞成分有明显改变。精液DNA流式细胞术分析可作为研究和诊断男性不育症的辅助方法。

基础医学研究生科研技能培养的模式探索

结合医学院校的实际情况,分析医学研究生科研技能培养面临的问题。文章阐述了对提高基础医学研究生的科研技能的尝试,从理论知识水平、实践技能以及科研素养等方面,探索如何培养严谨、创新和具有团队协作精神的高素质科研型人才。

定量PCR法测定人精子中DAZ基因的相对含量

目的 :建立测定人精子中DAZ基因相对含量的定量PCR法。 方法 :应用定量PCR法测定了 90例精子发生正常男性精子DNA中DAZ基因的相对含量 ,并确定其正常值范围。 结果 :以ZFX/ZFY基因为外部参照 ,精子发生正常男性精子DNA中DAZ基因的相对含量正常值为 1 47± 0 2 93。重复性试验结果表明其批内变异系数分别为 5 8%、6 5 % ,批间变异系数分别为 9 5 %、10 8%。 结论 :定量PCR法测定人精子中DAZ基因的相对含量是一种切实可行的检测方法。

YRRM1基因检测在无精症病因分析中的应用

YRRM（YchromosomeRNArecognitionmotif）为无精子因子（AZF）的重要候选成分，已证明YRRM的丢失可导致无精子或严重少精。应用PCR方法检测核型正常（46XY）的65例无精症男子和25例严重少精男子基因组DNA中的YRRM，发现6例无精症病人中有YRRM的丢失，严重少精病人中1例有YRRM的丢失。结果表明，应用该方法检测YRRM基因片段是切实可行的，对无精症和严重少精的病因诊断具有一定的应用价值。

假两性畸型小鼠睾丸胆固醇侧链裂解酶mRNA的异常表达

为了解假两性畸型（Ｔｆｍ）小鼠睾丸胆固醇侧链裂解酶（Ｐ４５０ｓｃｃ）ｍＲＮＡ的水平及影响其转录的机理，用反转录－多聚酶链反应比较了５ｄ、２０ｄ、２５ｄ和３０ｄ正常小鼠、Ｔｆｍ小鼠及３０ｄ手术隐睾小鼠睾丸Ｐ４５０ｓｃｃ的ｍＲＮＡ水平，正常小鼠在５～２０ｄ时，Ｐ４５０ｓｃｃｍＲＮＡ水平较低，从２５ｄ起明显增高，至３０ｄ时ｍＲＮＡ水平是５ｄ时的７５倍；Ｔｆｍ小鼠在５ｄ时，Ｐ４５０ｓｃｃｍＲＮＡ水平稍高于正常小鼠，但随后直至３０ｄ其水平未见明显增高，在３０ｄ时，Ｐ４５０ｓｃｃｍＲＮＡ总量低于正常小鼠１／１０；３０ｄ手术隐睾小鼠的Ｐ４５０ｓｃｃｍＲＮＡ水平低于正常３０ｄ小鼠１／２，高于Ｔｆｍ小鼠５倍。结果提示，２５ｄ的Ｌｅｙｄｉｇ细胞功能的形成需要受体介导的雄激素作用，而Ｔｆｍ小鼠由于编码雄激素受体基因突变，间接导致青春期Ｐ４５０ｓｃｃｍＲＮＡ的低水平。

利用cDNA微阵列技术筛选成年期与胚胎期睾丸差异表达基因——钙联接蛋白基因

目的 :用cDNA微阵列技术克隆和筛选成年期与胚胎期睾丸差异表达基因 ,以进行睾丸发育及精子发生的调控研究。 方法 :构建人睾丸cDNA芯片 ,分别用正常成人及胚胎睾丸的mRNA探针进行杂交 ,对成人和胚胎睾丸中差异表达的基因进行高流量的比较。 结果 :发现 1条成人睾丸高表达、胚胎低表达的基因———钙联接蛋白 (CLGN)基因。 结论

mRNA差异显示法筛选小鼠精子发生相关基因

目的筛选小鼠精子发生相关基因。方法应用改良的mRNA差异显示技术对1、2、3、4周龄小鼠睾丸进行了基因表达的差异显示分析,并对差异表达的cDNA片段进行了克隆和测序。结果获得了27个在不同周龄小鼠睾丸组织存在明显表达差异的基因片段,其中3个片段分别与Genbank中已知基因LTBP-3、rjs、P38 MAPK基因高度同源,其余基因片段为无同源序列的新基因片段。结论上述结果表明精子发生是一个多基因参与的过程,筛选出的这些基因可能在精子发生的不同阶段调控着精子发生的全过程。

男性无精子或少精子患者YRRM基因检测

ＹＲＲＭ（ＹｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅＲＮＡｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｍｏｔｉｆ）为ＡＺＦ（无精子因子）的重要候选成分。应用ＰＣＲ方法检测了５０例正常男子、２３６例无精子症和８２例严重少精子症男子基因组ＤＮＡ中的ＹＲＲＭ１和ＹＲＲＭ２基因，发现中国男子无ＹＲＲＭ２基因，２１例无精子症和３例严重少精子症患者有ＹＲＲＭ１的丢失。结果表明，应用该方法检测ＹＲＲＭ１基因片段是切实可行的。

小鼠睾丸雄激素受体mRNA与17α-羟化酶mRNA相关性研究

为了进一步揭示雄激素与17α-羟化酶的关系，本研究应用反转录-多聚酶链式反应的方法测定了正常小鼠、Tfm小鼠和手术隐睾小鼠睾丸中雄激素受体mRNA水平和17α-羟化酶mRNA的水平。结果显示：1．小鼠睾丸在发育过程中雄激素受体mRNA水平和17α-羟化酶mRNA的水平增加成正相关；2．Tfm小鼠睾丸中雄激素受体mRNA水平和17α-羟化酶mRNA水平均明显降低；3．手术隐睾小鼠睾丸，虽然雄激素含量下降，但雄激素受体mRNA水平及17α-羟化酶的mRNA水平均正常。结果提示了雄激素对17α-经化酶的调节作用。