利用邻位标记-质谱联用技术发掘冠状病毒HCoV-229E互作宿主因子

目的通过邻位标记-质谱联用与生物信息学分析结合筛选与人冠状病毒229E(HCoV-229E)核衣壳蛋白(NP)相互作用的潜在宿主因子,并利用免疫共沉淀等技术验证,寻找HCoV-229E NP的相互作用蛋白,为揭示病毒复制增殖的分子机制,及不同人冠状病毒致病力差异奠定基础。方法首先构建了表达HCoV-229E NP与生物素连接酶标签融合蛋白(NP-TurboID)的重组腺病毒Ad-V5-NP^(HCoV-229E)-TurboID(Ad-N),感染人非小细胞肺癌细胞A549,48 h后添加外源生物素,通过生物素连接酶标记NP相互作用蛋白,利用链霉亲和素交联的磁珠纯化生物素标记蛋白,而后进行无标记(label-free)蛋白质组学质谱分析,筛选出潜在的与NP互作的蛋白质,并通过免疫沉淀和免疫荧光等实验进行验证。结果无标记蛋白质组学质谱筛选出584个潜在互作蛋白,从中选取糖原合成酶激酶3(GSK3)A和GSK3B进行免疫共沉淀和免疫荧光验证,实验结果表明,二者与NP^(HCoV-229E)存在相互作用。结论邻位标记-质谱联用技术可以用于病毒-宿主相互作用因子的挖掘,为进一步研究冠状病毒复制、增殖及致病机制奠定了基础。