木薯MeSBE2基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建及验证

木薯淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成,淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE)是调控木薯支链淀粉合成的关键酶。木薯淀粉分支酶2(MeSBE2)由两个同源基因MeSBE2.1和MeSBE2.2编码,主要负责木薯支链淀粉的合成。该研究构建了MeSBE2.1和MeSBE2.2的双基因编辑载体并验证载体的编辑效果。利用在线软件CRISPR-P v2.0在保守区域设计同时靶标MeSBE2.1和MeSBE2.2的sg RNA,构建重组pCAMBIAP1301-Cas9-MeSBE2-g RNA质粒。将基因编辑载体转化农杆菌LBA4404后侵染‘华南8号’木薯脆性胚性愈伤组织。通过PCR扩增MeSBE2.1和MeSBE2.2的靶点区段,并将扩增片段进行Sanger测序和Hi-TOM分析基因编辑效果。结果发现MeSBE2.1和MeSBE2.2靶标位点被成功编辑,同时没有发生脱靶现象。本研究成功构建了MeSBE2.1和MeSBE2.2双基因编辑载体并验证了载体的有效性,有助于进一步获得MeSBE2基因的双突变体,获得高直链淀粉木薯。

木薯MeVINV1基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建及验证

液泡转化酶(vacuolar invertase,VINV)是参与植物蔗糖代谢、器官发育的关键酶之一。木薯MeVINV1在块根发育及淀粉积累阶段的表达活跃,对该基因进行编辑敲除,将有助于解析MeVINV1在木薯块根淀粉积累过程中的作用。本研究构建了MeVINV1的CRISPR/Cas9基因编辑载体,转化木薯脆性胚性愈伤组织以验证载体的编辑效果。结果发现:转化后的样品中,MeVINV1基因靶点位置出现测序多峰,而未转化样品中没有多峰出现,表明本研究构建的基因编辑载体可对MeVINV1基因进行编辑;检测分析潜在脱靶位点的序列,发现未出现脱靶现象。该研究为获得MeVINV1基因的突变体,明确其在木薯块根发育及淀粉积累过程中的功能奠定了基础。