基于核酸适配体的金黄色葡萄球菌快速检测试纸条的研制和应用

【目的】建立能快速检测金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析法。【方法】制备胶体金并表征,将其与核酸适配体连接后进行表征并喷涂于结合垫,以金黄色葡萄球菌多克隆抗体为检测线、核酸适配体互补序列为质控线制备试纸条,对样品垫与结合垫处理液、样品稀释液、重悬液、T线抗体浓度、适配体连接浓度等试验条件进行优化以获得最佳条件,同时检测试纸条的增敏效果,在最佳条件下对试纸条的灵敏度、特异性进行测试,制备人工污染样品用以评估试纸条在实际样品检测中的效果。【结果】胶体金粒径为20 nm左右,表征结果显示,胶体金与核酸适配体成功连接;试纸条样品垫与结合垫处理液、样品稀释液的最优条件为不同成分的SELEX缓冲液,金标适配体重悬液为HEPES重悬液,T线抗体浓度为2 mg/mL,适配体连接浓度为1μmol/L;用40 mmol/L羟胺与0.5%氯化金水溶液增敏,检测灵敏度为1×10^(4) CFU/mL,且具有良好的特异性,对于人工污染的肉样和奶样进行检测,灵敏度为1×10^(5) CFU/mL。【结论】本研究成功建立金黄色葡萄球菌试纸条检测方法,且该方法特异性良好,为进一步探讨核酸适配体在病原菌检测中的应用提供了理论依据。

单核细胞增生李斯特菌qPCR检测方法的建立及应用

【目的】为了建立一种快速、准确、可靠的畜产品中单核细胞增生李斯特菌荧光定量PCR检测方法。【方法】根据保守序列设计并筛选出一对特异性引物,经过反应体系及程序优化,建立染料法qPCR检测方法,并使用临床样品评价该检测方法的效果。【结果】建立的qPCR方法特异性较好,扩增,对纯培养细菌的检测限可达到10^(2)CFU/mL,检测方法变异系数小,稳定性高;对生猪肉和牛奶人工污染模型中的检测限为10^(3)CFU/mL,比普通PCR灵敏度高10倍。使用qPCR分别对50份牛奶样品和生猪肉样品检测,阳性率均为2.00%,与普通PCR方法验证结果一致。【结论】成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测单核细胞增生李斯特菌的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品单核细胞增生李斯特菌的检测。

靶向大肠杆菌DksA蛋白的小分子化合物的虚拟筛选及其体外抗菌活性的研究

大肠杆菌DksA蛋白是RNA聚合酶结合转录因子,前期研究发现其与大肠杆菌的多重耐药性相关。为获得靶向大肠杆菌DksA蛋白的小分子化合物,并鉴定其体外抗菌活性,本研究利用Openeye中的apopdb2receptor工具处理并生成基于DksA蛋白晶体结构(1TJL)模型、冷冻电镜结构(7KHE)模型和AlphaFold预测结构(AF)模型3个模型的3D结构,分析3个3D结构间的差异以及生成3个结构的叠合图,采用MOE中的SiteFinder插件搜寻各结构表面可能存在的化合物的结合口袋(Pocket),并分析pocket位置及其属性等指标。结果显示,DksA蛋白的3个3D结构高度重叠,3个结构表面均包含2个pocket,其中pocket1在3个模型中均优于pocket2,因此基于3个结构模型选择pocket1虚拟筛选(VS)小分子化合物。采用VS软件中的FRED对3个DksA蛋白3D结构的pocket1与38969个化合物进行分子对接,采用Chemgauss4打分函数通过亲和力对接打分得到对接分值(Docking score,该值为负值且值越小表示化合物与蛋白的相互作用越强,亲和力也越强)后经第一轮VS与DksA蛋白具有高亲和力的化合物;采用Stardrop软件分析小分子化合物属性和成药性属性,并计算成药性分值(Drug score)及类药五原则分值(Lipinski score),经第二轮VS成药性属性较好的化合物;采用MOE插件中的蛋白-配体相互作用指纹图谱(PLIF)经第三轮VS化合物与DksA蛋白的相互作用位点。结果显示,第一轮VS获得551个与DksA蛋白亲和力较高(-11 kcal/mol<docking score<-7 kcal/mol)的化合物。第二轮VS获得drug score>0.2以及lipinski score>0.4的340个与DksA蛋白有高亲和力和成药属性较好的化合物。第三轮VS结果显示,340个化合物中有296个化合物与DksA蛋白存在相互作用,并且获得了296个具有潜在活性靶向大肠杆菌DksA蛋白的化合物。其中95个化合物结合ppGpp和DksA蛋白的结合位点(Lys98、Arg129、Lys139),表明这些化合物间接影响细菌的耐药性和致病性。选择综合评分排名前40的化合物,通过菌悬液定量抑菌试验分别测定这些化合物在体外对大肠杆菌的抑菌率。结果显示,9个化合物对大肠杆菌标准株E的抑菌率达50%以上,其中有5个化合物(7、10、12、19和25)对大肠杆菌标准株E的抑菌率达80%以上。选择上述筛选出的9个化合物利用VS软件FRED与3种模型3D结构的DksA蛋白进行分子对接、亲和力打分和相互作用模式分析。结果显示,9个化合物与3种模型3D结构DksA蛋白的氨基酸通过氢键相互作用,docking score均较理想,且其周围分布着带正电荷的氨基酸。采用肉汤微量稀释法测定该9个化合物对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),分析化合物对大肠杆菌的抗菌活性。结果显示,其中4个化合物在低浓度时即可对大肠杆菌标准菌株和临床分离株起到杀菌作用。即化合物7、10、12和25对大肠杆菌标准株的MIC值分别为50μmol/L~100μmol/L,对其的MBC值分别为100μmol/~200μmol/L;对大肠杆菌临床分离株的MIC值分别为50μmol/L~100μmol/L,对其的MBC值分别为100μmol/L~200μmol/L。本研究借助VS技术首次筛选到4个具有显著抗菌活性的化合物,并经体外抗菌试验验证了这4个化合物的抗菌与杀菌活性,为开发防治多重耐药性大肠杆菌感染的新型靶向药物奠定了基础。

牛呼吸道合胞体病毒G蛋白特异性核酸适配体的筛选及初步应用

为筛选牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)G蛋白特异性核酸适配体,本研究通过原核系统表达G蛋白,并利用软件设计引物,由公司合成初始寡核苷酸文库,并利用微孔板法,经过包被G蛋白、封闭后加入初始寡核苷酸文库、洗脱、酚抽取法提取、PCR扩增、胶回收以及反筛等操作经不同轮次筛选核酸适配体。在每轮筛选循环中,以回收产物为模板进行常规PCR扩增后再进行一轮非对称PCR扩增,获得目的条带大小为84 bp的单链核苷酸分子,用于下一轮筛选。共进行了11轮筛选,从第5轮开始反筛。将最后一轮筛选得到的对称PCR产物连接T载体后转化到DH5α感受态细胞中,经菌液PCR鉴定和测序后,利用间接酶联核酸适配体法(i-ELAA)选择测序结果出现频次较高的适配体,测定其与G蛋白的结合力,并利用软件预测其二级结构。结果显示,本实验表达了BRSV重组G蛋白,经微孔板法筛选出了98条适配体序列,其中G-6、G-13、G-39、G-55和G-72适配体出现频率最高;二级结构预测显示,5条核酸适配体均具有稳定的茎环状或发卡状结构,能与G蛋白特异、稳定的结合。本研究筛选出的5条核酸适配体为BRSV酶联核酸适配体法的建立奠定了基础。

免疫层析技术在食源性细菌检测中的应用及优化

目前食品安全问题已经成为国家和社会关注的一项重点问题,食源性致病菌是引发食源性疾病的最主要因素。在全球各地均曾报道食源性致病菌如沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌等引起的食源性疾病事件。建立快速、准确检测食源性致病菌的方法是预防和控制相关疾病的前提。免疫层析技术在各个领域中发展迅速,应用广泛。文章主要综述了免疫层析技术在食源性细菌检测中的应用及该技术的优化方法,以期为今后开发快速检测技术提供理论支持。

转录调节因子DeoT对大肠埃希氏菌多重耐药性的影响

为全面鉴定大肠埃希氏菌转录调控因子DeoT调控的靶基因,阐明DeoT在多重耐药中的作用,以1株临床分离的大肠埃希氏菌E8菌株为亲本菌株,利用Red重组系统构建了deoT基因缺失株。E8ΔdeoT基因缺失株对6种常用抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)均低于亲本株E8。利用转录组测序技术分析了E8和deoT突变体的差异表达基因,结果显示E8ΔdeoT中118个基因出现差异表达,包括76个下调基因和42个上调基因。多数差异基因与细菌新陈代谢、ABC转运蛋白和转运蛋白/膜蛋白有关。其中由exbB编码的生物聚合物转运蛋白ExbB作为关键药物靶点,可能与E8ΔdeoT药物敏感性的增加相关。结果表明,DeoT直接或间接调控多个基因的表达,并在大肠埃希氏菌的多重耐药中起了重要作用。

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒噬菌体单链抗体库的构建和筛选

为筛选牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)gP48蛋白的单链抗体,本研究利用噬菌体展示技术构建了gP48蛋白单链抗体克隆文库,通过微孔筛选法对抗体库进行3轮富集淘筛,利用ELISA技术测定单链抗体的亲和力,对亲和力较高的克隆进行基因测序分析和结合活性测定,旨在获得gP48蛋白的单链抗体。结果表明:1)成功构建了库容量为4.3×10^(7)的噬菌体单链抗体库,其重组率为83.3%,经三轮筛选对噬菌体抗体库进行富集,富集倍数为1.43×10^(4);2)优化了间接ELISA方法,筛选到3株与BVDV gP48蛋白具有高亲和力的单链抗体以及其基因序列,通过IgBLAST分析显示,3株单链抗体均为鼠源IgG。综上,从gP48蛋白的单链抗体库中筛选获得3个具有高亲和力的单链抗体,可用于后续BVDV检测方法的建立。