重症肌无力P9-ZFD蛋白的骨骼肌亚细胞定位

目的 :表达、纯化重症肌无力相关P9基因TRAF型锌指结构 (P9TRAF typezincfingerdomain ,简称P9 ZFD)编码的蛋白质 ,制备P9 ZFD多克隆抗体 ,研究P9 ZFD蛋白的骨骼肌亚细胞定位。 方法 :应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR )克隆编码P9 ZFD的cDNA序列 ,构建pET2 4a P9 ZFD表达载体 ,在E .coliBL2 1(DE3)中胞内诱导表达P9 ZFD蛋白 ,组氨酸亲和色谱法纯化P9 ZFD蛋白并免疫Balb/c小鼠制备其多克隆抗体。ELISA和Westernblot鉴定抗体效价及其免疫特异性。免疫组织化学及免疫电镜观察P9 ZFD蛋白在骨骼肌中的表达部位及其亚细胞分布。结果 :表达、纯化的P9 ZFD蛋白相对分子质量约 30kD ,纯度达 95 %以上。制备的P9 ZFD抗体具有特异的免疫反应性。免疫组织化学和免疫电镜结果显示 ,P9 ZFD蛋白的免疫染色部位集中沿MG骨骼肌细胞膜分布。结论 :重症肌无力相关的P9 ZFD蛋白在MG骨骼肌细胞膜处表达 ,是一种骨骼肌细胞膜蛋白组分。

重症肌无力相关基因P9TRAF型锌指结构域的表达及抗体制备

目的 克隆重症肌无力相关基因P9 TRAF型锌指结构域(P9 TRAF-type zinc finger domain,简称P9-ZFD)的cDNA片段及表达其编码的蛋白质,制备P9-ZFD多克隆抗体。方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)克隆编码P9-ZFD的cDNA序列,构建pET24a-P9-ZFD表达载体,在E.coli BL21(DE3)宿主菌中胞内诱导表达P9-ZFD蛋白,用经组氨酸亲和层析纯化的P9-ZFD融合蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,Western blot鉴定抗体的免疫特异性。结果 扩增的P9-ZFD基因片段经测序证实与基因库报道的序列完全一致。表达、纯化的P9-ZFD融合蛋白相对分子质量约30 000,其纯度达 95％以上。制备的P9-ZFD抗体仅与纯化的P9-ZFD融合蛋白产生特异性免疫反应。结论 P9基因TRAF型锌指结构域编码的蛋白质能够在原核细胞中表达,并能获得具有特异免疫反应性的P9-ZFD多克隆抗体。

重症肌无力P9-ZFD基因片段表达蛋白的研究

目的:探讨P9-ZFD基因片段在人骨骼肌中表达的蛋白质。方法:以MG骨骼肌RNA为模板,扩增编码P9-ZFD片段的cDNA,构建pFT24a-P9-ZFD表达载体,经BL21(DE3)诱导表达P9-ZFD蛋白和组氨酸亲和层析法进行纯化,并制备P9-ZFD抗体。Western blot鉴定MG和对照组骨骼肌中与P9-ZFD抗体产生特异性免疫反应的蛋白组分。结果:骨骼肌中与P9-ZFD抗体产生特异性免疫反应的蛋白质相对分子质量约40000,在伴胸腺增生或胸腺瘤MG骨骼肌中的表达水平明显高于对照组(P<0.001)。结论:骨骼肌中40 000的蛋白是P9-ZFD基因片段的编码产物,该蛋白在伴胸腺增生或胸腺瘤MG骨骼肌中的表达水平明显上调,可能具有重要的病理生理意义。