柯萨奇病毒A16型VP1亚单位疫苗构建

柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CVA16)属于小RNA病毒科肠道病毒属,是手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)的主要病原体之一。近年来发现,CVA16感染的病患可引起脑部、肺部和心脏等的继发感染,甚至还可能引发肺炎、心肌炎和难治性休克等致死性并发症。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit,LTB),可作为特异性抗原的黏膜佐剂,用以增强特异性抗原的血清IgG抗体应答。大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒素B亚单位(Escherichia coli type-Ⅱheat-labile enterotoxin B subunit,LT2B)具有比LTB更强的佐剂活性。本实验对CVA16VP1与LT2B融合蛋白作为抗原的免疫原性的研究,将初步评价产生的抗体的抗体效价,为进一步研究柯萨奇病毒的新型疫苗奠定基础。本研究构建pET32-CVA16VP1-LT2B融合表达载体,诱导表达CVA16VP1-LT2B蛋白,用于免疫小鼠,采取血清,检测特异性抗体效价。结果表明,本研究成功构建了pET32-CVA16VP1-LT2B融合表达载体,并成功提取到纯化的CVA16VP1-LT2B蛋白,间接ELISA检测出抗体效价为1∶800。

PT8A的粘膜免疫佐剂活性初步研究

本研究发现位于大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(heat-labile enterotxin B subunit,LTB)的8肽(octapetptide,PT8A)具有一定的佐剂活性。我们用PT8A联合人手足口病病毒的VP1(EVP1)鼻腔免疫Balb/c小鼠,通过间接ELISA法检测小鼠血清中的特异性EVP1抗体滴度,检测结果显示PT8A+EVP1组相比PBS组和EVP1组有明显佐剂活性,初步验证了PT8A的佐剂活性。对PT8A和LTB蛋白的佐剂活性进行比较研究,结果显示,PT8A的佐剂活性明显弱于LTB,有待进一步提高。通过对PT8A免疫原性进行检测分析发现,PT8A的免疫原性明显减弱,初步确定PT8A在保留佐剂活性的同时自身免疫原性明显减弱,具有进一步开发为粘膜免疫佐剂候选分子的潜力。

LTB抗原表位PT8A与重组轮状病毒VP8~*亚单位疫苗融合后的免疫效应研究

为评价LTB（大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位）抗原表位PT8A与人轮状病毒（rotavirus,RV）VP8＊基因融合后对VP8＊亚单位疫苗（VP8）免疫效果的影响,将PT8A分别融合到VP8＊基因的C-端和N-端,然后构建重组表达质粒p ET32a-PT8A-VP8和p ET32a-VP8-PT8A。表达的重组蛋白PT8A-VP8和VP8-T8A纯化后分别经鼻腔免疫BALB/c免疫小鼠,收集血清,间接ELISA法检测血清抗体水平。经测序鉴定,重组质粒p ET32a-PT8A-VP8和p ET32a-VP8-PT8A构建成功。6×His-VP8-PT8A、6×His-PT8A-VP8融合蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量（Mr）约为34 k D。重组VP8-PT8A和PT8A-VP8表达成功,融合蛋白主要以包涵体形式表达。间接ELISA测量血清Ig G和肺s Ig A的滴度,与VP8组相比较,VP8＋LTB组和VP8-PT8A组OD值有显著性差异（p〈0.05）,PT8A-VP8组OD值没有显著性差异（p〉0.05）。即PT8A融合在VP8基因的C端后对重组轮状病毒VP8＊亚单位疫苗有显著性免疫佐剂活性。

PT8A关键氨基酸残基鉴定及其免疫佐剂活性分析

持粘膜和肌内佐剂的活性。PT8A来源于大肠杆菌耐热肠毒素B亚单位(LTB)的T细胞表位和B细胞表位(78~85 aa)。本研究共构建了3个PT8A突变体在HRV VP8*亚单位疫苗的C末端与VP8*基因融合。用分子内佐剂PT8A及其突变体蛋白对雌性Balb/c小鼠进行鼻腔免疫,并用间接ELISA法检测血清IgG水平。VP8-CgR5(Q5G)和VP8-ChR8(A8H)突变株的血清特异性IgG水平均显著高于原株VP8-PT8A。结果表明,PT8A中Q5G和A8H的突变增强了PT8A的黏膜佐剂活性,PT8A的突变S4G对PT8A的佐剂活性无影响。