云南红豆杉愈伤组织培养及其生产紫杉醇的研究

云南红豆杉愈伤组织培养及其生产紫杉醇的研究甘烦远彭丽萍郑光植（中国科学院昆明植物研究所昆明６５０２０４）从红豆杉科红豆杉属植物如短叶红豆杉（Ｔａｘｕｓｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）等的树皮或枝叶提取到的紫杉醇（Ｔａｘｏｌ）是一种具有强抗癌活性的二萜烯类化合...

高效液相色谱法测定红豆杉培养细胞中紫杉醇的含量

采用Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ Ｃ_６Ｈ_５柱，以甲醇：乙腈：水（２：３：８．５）为流动相，在２２８ｎｍ波长下检测，对３种红豆杉即云南红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）、红豆杉（Ｔ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）和欧洲红豆杉（Ｔ．ｂａｃｃａｔａ）培养细胞中紫杉醇（Ｔａｘｏｌ）的含量进行了测定。建立了一套简单、快速、准确的测定红豆杉培养细胞中紫杉醇的高效液相色谱方法，最低检出量可达０．５μｇ。

云南红豆杉细胞发酵培养的研究

利用云南红豆杉(Taxus yunnanensis)细胞悬浮培养的最佳培养条件,进行了细胞10L规模的发酵培养研究。对细胞发酵培养过程中的pH值变化、糖利用率以及细胞生长周期等实验参数进行了测定。已进行的3次发酵培养的实验结果表明:培养细胞的生长率已达0.4g/L.d(即12.0g/L),培养细胞中紫杉酵的含量为0.119％(其中培养液中的紫杉醇含量约占42％)。初步建立了优化的云南红豆杉细胞大量培养系统。

三七化学成分研究概况

本文对三七化学成分研究的进展作了概述。三七含有多种化学成分,其中三七皂甙是三七的主要有效成分之一,目前已从三七各不同生长部位中分离并鉴定到20种单体皂甙成分;三七还含有其它的药用成分如三七素、黄酮、挥发油、氨基酸、植物甾醇、糖类及无机盐和无机离子等。本文同时对三七皂甙成分的提取、分离及含量测定方法作了评述。

云南红豆杉细胞的悬浮培养

在云南红豆杉细胞悬浮培养中，适宜的培养基为B5，接种量为0．5～0．8g干重细胞／100ml培养基，2，4－D浓度为1．0mg／L；培养细胞的生长周期约30d；培养基中较高浓度的蔗糖（40g／L）可提高紫杉醇含量；添加的椰子汁（CM）、酪蛋白氨基酸（C）和水解乳蛋白（LH）3种有机添加剂均能提高培养细胞中紫杉醇的含量，但只有CM和CA能促进细胞的生长。于B5培养基中添加不同浓度的NH4NO3对培养细胞无明显影响。

云南红豆杉细胞培养中紫杉醇的代谢调控

云南红豆杉细胞培养中紫杉醇的代谢调控甘烦远彭丽萍郑光植（中国科学院昆明植物研究所，昆明６５０２０４）ＭＥＴＡＢＯＬＩＣＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮＯＮＴＡＸＯＬＯＦＣＥＬＬＣＵＬＴＵＲＥＦＲＯＭＴＡＸＵＳＹＵＮＮＡＮＥＮＳＩＳＧＡＮＦａｎ－Ｙｕａｎ，ＰＥＮ...

红豆杉细胞培养的研究

从红豆杉（Ｔａｘｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｐｉｌｇ．）Ｒｅｈｄ．）的嫩茎及针叶诱导出愈伤组织，对愈伤组织培养及细胞悬浮培养进行了研究。利用ＨＰＬＣ方法测定了它们合成紫杉醇的能力。发现了能够提高培养细胞生长速率及紫杉醇含量的一些因子。红豆杉愈伤组织及悬浮培养细胞的生长速率已分别达到０．２５ｇ／Ｌ．ｄ和０．２８ｇ／Ｌ．ｄ。而他们的紫杉醇含量分别是０．００２６％和０．０１２％。

紫杉醇生物合成的研究进展

本文对近年来研究紫杉醇的生物合成及生物合成途径中关键酶的进展进行了评述。目前紫杉醇的生物合成途径已经基本明了，其生物合成途径中环化酶的基因已经克隆成功。在分子及基因水平上大量生产紫杉醇的曙光已经出现。

三七愈伤组织分化的研究

对三七(Panax notoginseng)无菌苗中诱导出的愈伤组织进行了分化试验。结果表明,不同的植物激素对三七愈伤组织的分化具有很大的影响。在MS培养基中加入0.5—1.0mg/L的IBA或IAA能促进愈伤组织根的分化;而加入0.5—1.0mg/L的BA则能促进愈伤组织芽的分化,但它们的分化率都不很高。其它的植物激素如2,4-D,NAA和KT等对三七愈伤组织分化影响不大,但亦改变愈伤组织的生长状态。把在含BA的培养基上分化的芽转移至含IBA的培养基中培养时,会生长出根,建立了完整的再生植株。再生植株培养于含1.0mg/L IBA+0.1mg/L BA的MS培养基中,能正常生长,其平均生长速率为75.0mg DW/L.d。对分化的三七愈伤组织与未分化的三七愈伤组织进行了有效成分之一皂甙含量的比较。结果发现,分化的三七愈伤组织皂甙含量为3.39％,比未分化的愈伤组织(皂甙含量1.34％)高1.5倍。

红花愈伤组织诱导、生长及其α-生育酚的产生

通过TLC和HPLC初步分析和鉴定,证明从红花(Carthamus tinctorius)无菌苗的胚根、胚轴及子叶和花蕾中诱导出的愈伤组织均具有合成α-生育酚的能力。其中以胚轴的愈伤组织和悬浮培养细胞的生长速率及α-生育酚的含量较高,分别达到0.35、0.39克干重/升·天和0.62、2.28毫克/100克干重样品。对红花细胞生长较适宜的培养基为MC培养基。培养基中附加10％椰子汁或0.1％酪蛋白氨基酸可使细胞生长显著提高,分别达到0.45和0.41克干重/升·天。

寡糖素对红花及三七培养细胞的生理作用

三种寡糖素，即来自人参（Ｐａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇ）培养细胞的人参寡糖素、红花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃ－ｔｏｒｉｕｓ）培养细胞的红花寡糖素、黑节草（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）植物的黑节草寡糖素对红花及三七（Ｐａｎａｘｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ）的培养细胞的生长及代谢产物的含量均有显著的促进作用。寡糖素可耐高温高压（１２１℃、１．２ｂｓ／ｃｍ￣２）灭菌１５分钟而不失活，其对植物培养细胞的影响与利用过滤方法灭菌的效果相似。红花寡糖素对红花悬浮培养细胞作用的适宜浓度是５—１０ｍｇ／Ｌ，而在愈伤组织中为１５ｍｇ／Ｌ。在三七培养细胞进入生长旺盛（培养至２２天）时加入黑节草寡糖素，再培养２天后其生长即提高，黑节草寡糖素均能缩短红花及三七培养细胞生长的延缓期，提前进入对数生长期及指数生长期。并且使红花培养细胞中α—生育酚在细胞生长最活跃的指数生长期大量积累，最终增加了培养细胞及代谢产物的产率。

各种因素对红花培养物中细胞生长及α-生育酚含量的影响

红花(Carthamus tinctorius)无菌苗的不同器官(胚恨、胚铀及子叶)和红花花蕾均能诱导出愈伤组织,这些愈防组织均有合成α-生育酚的能力。其中以由胚轴而来的愈伤组织的生长速率及α-生育酚含量为最高、蔗糖(30g/L)有利于细胞的生长,葡萄糖(30g/L)有利于α-生育酚的积累。高含量的肌醇(0.55%)不仅促进细胞生长,而且明显刺激产物含量的增加。当细胞接种量为0.035—0.067g千重/瓶(50ml体积)时,细胞生长速率达到最高。培养于高浓度的CO_2(5%)条件下可有效地提高α-生育酚的积累。培养基中加入0.45—0.55%肌醇、10%椰子汁、0.1—0.5%酪蛋白氨基酸、30g/L蔗糖和10g/L的葡萄糖时,细胞的生长速率、α-生育酚含量和产率分别是对照的1.88.2.03和3.30倍。

植醇与寡糖对红花悬浮培养细胞的生长及α-生育酚积累的效应

在红花细胞悬浮培养基中加入α-生育酚的前体植醇能显著增加α-生育酚的积累,较高浓度的植醇(50～100 ppm)能同时促进细胞的生长。在培养基中加入抗氧剂角鲨烯也能提高α-生育酚的积累。诱导因子寡糖对细胞的生长和α-生育酚含量均有提高作用,其中以寡糖F_(11)效果较佳。悬浮细胞培养基中同时加入15ppm的寡糖F_(11),75ppm的植醇和100 ppm的角鲨烯,细胞生长速率可提高23.81％,α-生育酚含量及产率分别比对照提高2.8倍和3.6倍。

人参寡糖素对三七悬浮培养细胞生长的效应

从人参培养细胞的细胞壁中分离纯化到不同分子量的单体人参寡糖素。试验结果表明命名为人参寡糖素Ⅶ和人参寡糖素Ⅷ的两种寡糖素对三七悬浮培养细胞的生长具有明显的促进作用，其增长率分别为１９．３４％和１０．５８％，人参寡糖素Ⅶ的适宜浓度为５—１０ｍｇ／ｌ。在高浓度下（大于２５ｍｇ／ｌ）稍抑制培养细胞生长。在细胞培养２２天（指数生长期）后．加入１０ｍｇ／ｌ的人参寡糖素Ⅶ．然后再培养２天。其生长速率即提高，加入人参寡糖素Ⅷ后．缩短了三七细胞悬浮培养生长的延缓期．提前进入对数生长期和指数生长期，并在对数生长期和指数生长期作用最明显，因而最终收获时培养细胞的产率增加。

欧洲红豆杉细胞培养的研究

从欧洲红豆杉（Ｔａｘｕｓｂａｃｃａｔａ）的嫩茎及什叶诱导出愈伤组织，并对之进行了愈伤组织培养及细胞悬浮培养研究；利用ＨＰＬＣ方法测定了培养物合成紫杉醇的能力．探索了提高培养细胞生长率及紫杉醇含量的一些措施．结果表明，欧洲红豆杉愈伤组织及悬浮培养细胞的生长速率已分别达到０．２７ｇ·Ｌ－１·ｄ－１和０．３５ｇ·Ｌ－１·ｄ－１，紫杉醇含量分别为０．００３１％和０．０１７％。

红豆杉培养细胞紫杉醇的分离及鉴定

红豆杉培养细胞紫杉醇的分离及鉴定甘烦远，郑光植，彭丽萍，沈月毛（中国科学院昆明植物研究所昆明６５０２０４）关键词红豆杉；紫杉醇；细胞培养；分离鉴定ＩＳＯＬＡＴＩＯＮＡＮＤＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＴＡＸＯＬＦＲＯＭＣＵＬＴＵＲＥＤＣＥＬＬＳＯＦ...

提高植物培养细胞中次级代谢产物含量的途径

利用植物细胞培养的方法可以取代人工栽培、天然采集或人工合成的方法大量生产很多具有价值的产物(如药品、农药、香料、色素及食品添加剂等)。目前,利用紫草(Lithospermum erythrochizon)培养细胞生产紫草素,利用人参(Panax ginseng)根培养物生产食品添加剂等已进入商业市场。另外,利用黄连(Coptisjaponica)培养细胞生产小蘗碱、利用长春花(Catharathus roseus)培养细胞生产蛇根碱及阿吗碱和利用毛地黄(Digitalis lanata)培养细胞生产地高辛等亦都进行了工业化生产。尽管这样,由于植物培养细胞亦存在着一些缺点如很多培养物中代谢物含量很低或不存在,生长速度缓慢加上目前发酵成本过高、很多关键性问题未解决等等,使之未能广泛地应用于工业化生产。近年来,为了解决上述诸问题特别是解决培养物中代谢物含量低的问题,各国科研人员进行了不懈的努力,取得了长足的进展。本文着重对这方面近年来采用的新方法及新技术的研究作一概述。

人参寡糖素M对红花培养细胞生长与α-生育酚形成的影响

人参寡糖素M能提高红花(Carthamus tinctorius)培养细胞的生长速率和培养细胞中代谢产物α-生育酚的含量。其最适作用浓度在愈伤组织培养中为5mg/L。在红花细胞悬浮培养加入人参寡糖素M1d后,培养细胞中α-生育酚的含量即提高,但由于累积效应,因而于细胞接种当天同时加入人参寡糖素M对细胞生长和α-生育酚含量的提高效果较好。加入人参寡糖素M可缩短红花悬浮培养细胞生长的延缓期,并于指数生长期作用最明显;另外可使细胞生长及α-生育酚积累同时提前达到最高值,因而缩短了细胞收获时间。

红花细胞培养中高产α-生育酚克隆系的筛选

为了从红花(Carthamus tinctorius L.)培养细胞中筛选到具有高产α-生育酚性能的细胞变异体,利用细胞平板培养技术,利用HPLC法测定培养细胞中α-生育酚的含量,对200多个由单细胞或小细胞团发育而来的细胞克隆进行了筛选。结果发现,在细胞生长速率和α-生育酚含量上,这些克隆之间存在着显著的差异。在克隆的第一代分析过程中,发现α-生育酚含量由0—138.9μg/gDW变化;细胞生产速率由0.20—0.53gDW/1.d变化。细胞生长速率与α-生育酚含量之间无明显相关性。对一些α-生育酚含量较高的克隆进行了稳定性观察,经近20代继代培养观察后,从中筛选到一个合成α-生育酚较稳定的高产克隆系(CT-289),其α-生育酚平均含量为114.4μg/gDW,是原始株系(15.83μg/gDW)的7.2倍;其生长速率为0.424gDW/1.d,与原始株系(0.417gDW/l.d)相差不大。